海洋贝类在海水养殖业中占据重要地位，优良品种的开发是保障海洋贝类养 殖业可持续发展的关键。基因编辑技术作为一种精准、高效的技术手段，可以定 向改造靶基因，快速获得性状改良的个体，可望发展成为新一代育种技术，因此 开发适用于海洋贝类的基因编辑技术体系具有重要意义及价值。

       本文以杂交鲍（Haliotis discus hannai ♀ × H. fulgens ♂）为主要研究对象，对 海洋腹足经济贝类的基因编辑育种技术开展了系统研究。利用整装原位杂交 （WMISH）分析了基因的表达规律，筛选了遗传操作的靶基因，分别利用显微 注射和电穿孔方法探索了将sgRNA/Cas9 复合物和 siRNA 等外源物质导入卵细 胞并针对靶基因进行遗传操作（特别是基因编辑）的技术方法。主要结果如下：

      1. 在杂交鲍中筛选了基因编辑的靶基因并分析其表达规律。为探索海洋腹 足经济贝类的基因编辑育种技术，须首先选定基因编辑的靶基因。筛选靶基因的 标准主要包括两个，一是将该靶基因敲除后，幼虫性状发生明显的改变，二是与 重要经济性状有关。基于上述筛选标准，本研究选定了calaxin和tyrosinase两类 基因，分别与纤毛和贝壳性状相关。共筛选到三个靶基因，分别命名为Hdf-calaxin、 Hdf-Tyr1 和 Hdf-Tyr2，并通过整装原位杂交实验分析了其在杂交鲍早期发育幼虫 的表达模式。结果表明，Hdf-calaxin基因在担轮幼虫和面盘幼虫的担轮环区域呈 环状特异性表达；Hdf-Tyr1和Hdf-Tyr2基因在担轮幼虫的贝壳发育区呈“U”形表 达模式，在面盘幼虫的外套膜缘区域特异性表达。这些结果提示 Hdf-calaxin 基 因参与幼虫纤毛发育的调控过程，而Hdf-Tyr1和Hdf-Tyr2 基因参与杂交鲍贝壳 的形成过程。

       2. 在杂交鲍中探索了基于显微注射的基因编辑技术。上述筛选的靶基因中， Hdf-calaxin 基因与纤毛性状相关，推测将该基因敲除后幼虫表型变化明显，便于 快速判定基因编辑结果，因此将其作为基因编辑育种技术实践的首选。在导入手 段的选择方面，鉴于显微注射技术具有精准和高导入效率等特点，且在本课题组 中有良好的技术基础，因此首先初步探索了显微注射介导的鲍基因编辑技术。通 过显微注射技术将calaxin sgRNA/Cas9蛋白混合物导入杂交鲍卵细胞后，约70% 的胚胎注射成功。部分注射组幼虫的纤毛缩短、运动能力下降，提示注射后幼虫 纤毛发育受到了干扰，与预期结果相符。对基因组靶部位测序结果表明，在注射 特定的3个sgRNA后，目标部位出现了大量不同类型的突变，显示基因编辑成 功。为进一步获得基因编辑品系，尝试将上述编辑后的幼虫培育为稚贝。针对基 因编辑幼虫数量有限的特点，专门开发了小水体（数毫升）内培育幼虫的方法， 辅以γ-氨基丁酸（GABA）诱导变态策略，成功将部分编辑后G0代幼虫培育至稚贝阶段。上述结果表明利用显微注射技术在杂交鲍中先后实现了外源物质的导 入、靶基因的敲除、幼虫性状的改变以及编辑后稚贝的培育，为后续实现基因编 辑育种提供了技术基础。

       3. 初步探索了海洋腹足贝类中电穿孔介导的遗传操控技术。如前所述，显 微注射技术通量小难以满足基因编辑育种的需求，与之相比，电穿孔技术具有通 量大、操作相对简单的独特优势。因此，我们选择了具有大通量优势的电穿孔技 术，对电穿孔介导的遗传操作技术进行了大量的前期探索。同时杂交鲍材料的供 应受繁殖季节性限制，因此首先使用实验室建立的模式贝类—北戴河笠贝（Lottia peitaihoensis）探索适宜的电穿孔条件。通过对电穿孔参数的大量探索实验，成功 建立可以将示踪染料（Lucifer Yellow）、sgRNA/Cas9 及荧光标记的 siRNA 等外 源物质导入北戴河笠贝卵细胞的电穿孔条件。尽管导入sgRNA/Cas9后仍存在幼 虫无法发育的难题，但导入 siRNA 后的幼虫可以发育。原位杂交结果表明，约 70%导入calaxin siRNA 的胚胎中calaxin mRNA表达水平明显下降，实现了对靶 基因的敲降。基于在北戴河笠贝中的探索经验，尝试了对杂交鲍卵细胞进行电穿 孔实验，成功将示踪染料导入杂交鲍卵细胞，并获得了基本正常发育的幼虫。 基于上述研究，确定了将外源物质导入北戴河笠贝和杂交鲍卵细胞的电穿孔条件， 并初步在北戴河笠贝中实现了电穿孔技术介导的遗传操作实验，为在杂交鲍中实 现电穿孔技术介导的遗传操作（如基因编辑）奠定了基础。

       综上所述，本研究以建立基因编辑育种技术为目标，在以鲍为代表的海洋腹 足经济贝类中利用显微注射和电穿孔两种技术策略开展了探索。利用显微注射技 术在杂交鲍中实现了基因编辑，并将编辑后 G0 代杂交鲍幼虫培育至稚贝阶段； 利用电穿孔技术成功将外源物质导入了杂交鲍和北戴河笠贝的卵细胞，并在北戴 河笠贝中实现了基因敲降。上述研究结果丰富了海洋经济贝类遗传操作技术体系， 为在海洋贝类中构建完善的基因编辑育种技术提供了重要支撑。

第1章 绪论 ............................................................................................ 1

1.1 贝类基因编辑育种研究概述 ............................................................................. 1

1.1.1 贝类的重要经济地位 .................................................................................. 1

1.1.2 改良品种的主要策略 .................................................................................. 1

1.2 基因编辑技术、导入方式简介及应用 ............................................................. 2

1.2.1 基因编辑技术及分类 .................................................................................. 3

1.2.2 基因编辑导入方式 ...................................................................................... 7

1.2.3 基因编辑技术的应用 .................................................................................. 8

1.3 贝类基因编辑研究进展 ..................................................................................... 9

1.4 本研究的目的和意义 ....................................................................................... 12

第2章 calaxin和tyrosinase基因在杂交鲍早期幼虫时期的表达规律分析 .......................................................................................................15

2.1 研究背景 ........................................................................................................... 15

2.2 材料与方法 ....................................................................................................... 15

2.2.1 杂交鲍幼虫的培养与固定 ........................................................................ 15

2.2.2 基因序列扩增及特征分析 ........................................................................ 16

2.2.3 探针合成 .................................................................................................... 16

2.2.4 整装原位杂交 ............................................................................................ 19

2.3 结果 ................................................................................................................... 20

2.3.1 杂交鲍Hdf-calaxin、Hdf-Tyr1和Hdf-Tyr2基因的序列特征分析 ....... 20

2.3.2 杂交鲍Hdf-calaxin、Hdf-Tyr1和Hdf-Tyr2的聚类分析 ...................... 21

2.3.3 Hdf-calaxin、Hdf-Tyr1、Hdf-Tyr2基因在杂交鲍早期发育中的表达分析 .................................................................................................................................. 22

2.4 讨论 ................................................................................................................... 23

第3章 基于显微注射的杂交鲍基因编辑技术探索 .........................25

3.1 研究背景 ........................................................................................................... 25

3.2 材料与方法 ....................................................................................................... 26

3.2.1 杂交鲍生殖细胞的获得与幼虫培养 ........................................................ 26

3.2.2 Hdf-calaxin基因结构分析及sgRNA的合成 .......................................... 26

3.2.3 sgRNA/Cas9 RNPs复合物的注射 ............................................................ 26

3.2.4 基因编辑后幼虫的表型和基因型分析 .................................................... 27

3.2.5 基因编辑幼虫培养条件的探索 ................................................................ 29

3.3 结果 ................................................................................................................... 30

3.3.1 Hdf-calaxin基因的结构及不同sgRNA组合的筛选 .............................. 30

3.3.2 注射sgRNA/Cas9复合物幼虫的表型分析 ............................................ 32

3.3.3 注射sgRNA/Cas9复合物幼虫的基因型分析 ........................................ 33

3.3.4 基因编辑幼虫的后续培养 ........................................................................ 35

3.4 讨论 ................................................................................................................... 37

3.4.1 sgRNA的位置影响突变效率 .................................................................... 37

3.4.2 sgRNA的数量和浓度影响突变效率 ........................................................ 38

3.4.3 突变幼虫的嵌合表型 ................................................................................ 39

3.4.4 总结 ............................................................................................................ 39

第4章 电穿孔介导的海洋腹足贝类遗传操控技术的初步探索 ........................41

4.1 研究背景 ........................................................................................................... 41

4.2 材料与方法 ....................................................................................................... 42

4.2.1 北戴河笠贝生殖细胞的获取 .................................................................... 42

4.2.2 电穿孔条件的优化 .................................................................................... 42

4.2.3 calaxin siRNA的合成及工作浓度的优化 ................................................ 45

4.2.4 电穿孔介导的北戴河笠贝RNA干扰 ..................................................... 46

4.2.5 整装原位杂交 ............................................................................................ 47

4.2.6 杂交鲍的电穿孔实验 ................................................................................ 47

4.3 结果 ................................................................................................................... 47

4.3.1 不同参数对北戴河笠贝卵细胞电穿孔结果的影响 ................................ 47

4.3.2 电穿孔介导的RNA干扰 ......................................................................... 49

4.3.3 杂交鲍电穿孔技术的初步探索 ................................................................ 53

4.4 讨论 ................................................................................................................... 54

4.4.1 电穿孔参数对导入结果的影响 ................................................................ 55

4.4.2 siRNA浓度对北戴河笠贝calaxin基因干扰效率的影响 ....................... 55

4.4.3 RNA干扰后北戴河笠贝幼虫calaxin mRNA表达的均一性及表型效应 ...................................................................................................................................... 56

4.4.4 杂交鲍的电穿孔实验 ................................................................................ 57

4.4.5 总结 ............................................................................................................ 57

第5章 结论和展望 .............................................................................59

5.1 结论 ................................................................................................................... 59

5.2 创新性 ............................................................................................................... 59

5.3 问题和展望 ....................................................................................................... 60

参考文献 ...................................................................................................61

附录一 N-SC组幼虫的靶位点序列 ......................................................71

附录二 N-LC组幼虫的靶位点序列 ......................................................72

附录三 AN组幼虫的靶位点序列 ..........................................................73

致谢 ...........................................................................................................75

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 ......77