球参（Phyllophorus proteus）是来自印尼等热带海域的一种海参，资源量大，但目前尚未得到广泛应用。硫酸化多糖是海参的主要活性成分之一，具有抗凝血、抗氧化、降血糖等多种生物活性，但不同海参来源的硫酸化多糖结构和功能差异很大。本论文以球参为原料，从球参中分离纯化硫酸化多糖，并对其结构特征和抗凝血及免疫调节作用进行评价，以期为球参资源的高值化利用提供科学依据。本研究取得的主要研究结果如下：

（1）通过酶解碱解联用的方法从干燥球参体壁中提取得到粗多糖，提取率为2.86%。采用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析，梯度洗脱获得对应洗脱浓度分别为0.4 M、1.1 M、1.4 M、2.0 M NaCl的四个分级组分，并在后续分离中采用分步洗脱以上述四个浓度进行洗脱获得了球参多糖分级组分。对各分级组分进行分析，结果显示1.1 M NaCl洗脱组分为岩藻糖化糖胺聚糖FG，由岩藻糖（Fuc）、葡萄糖醛酸（GlcA）、乙酰氨基半乳糖（GalNAc）构成，分子量（Mw）为67.1kDa；2.0 M NaCl洗脱组分为岩藻聚糖硫酸酯FS，由岩藻糖构成，分子量为137.8kDa。使用Sephadex G100凝胶柱层析分别对FG与FS进行纯化得到两种多糖的纯化组分。

（2）使用β消除的方法对FG降解得到产物dFG。对dFG进行核磁共振分析，结果显示，dFG的主链由GalNAc与GlcA以β-1, 3与β-1, 4糖苷键交替连接构成，并在GlcA的C-3位上存在α-1, 3糖苷键连接的不同硫酸基取代的岩藻糖侧链。体外抗凝血活性实验结果显示FG能够显著延长活化部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（Prothrombin time，PT）、凝血酶时间 （Thrombin time，TT）和纤维蛋白原（Fibrinogen，FIB）时间，表明其具有非常显著的抗凝血活性。dFG能够显著延长APTT和FIB的凝血时间，但对PT没有明显影响，即dFG可以影响内源性凝血途径，但不能影响外源性凝血途径。抗炎活性实验结果显示FG与dFG在25-200 μg/mL的浓度时均能够抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的产生，且NO的生成量随着药物浓度的增加而降低，说明FG及dFG均具有较好的抗炎活性。

（3）使用10 mM 三氟乙酸（TFA）对FS降解得到产物dFS。对dFS进行核磁共振分析，结果显示，dFS为硫酸化岩藻聚糖。体外免疫调节活性实验结果显示FS及dFS均能够促进RAW 264.7巨噬细胞产生NO，具有免疫刺激活性，dFS的促炎活性稍弱于FS。FS能够显著地促进促炎因子IL-6及IL-1β在mRNA水平上的表达，并且表现出剂量依赖效应，dFS能够显著促进IL-1β的表达。ELISA结果显示FS能够显著地促进促炎因子IL-6在蛋白水平上的表达，100 μg/mL的FS能够促进TNF-α的产生，dFS同样可以显著地促进IL-6及TNF-α的产生。FS及dFS较强的免疫刺激活性提示其具有开发成为效果较好的免疫佐剂的潜力。

 

第1章 绪论... 1

1.1 海参的研究概况... 1

1.2 海参硫酸化多糖的研究概况... 2

1.2.1 海参硫酸化多糖的提取... 2

1.2.2 海参硫酸化多糖的分离纯化... 3

1.2.3 海参岩藻聚糖硫酸酯的结构研究概况... 4

1.2.4 海参岩藻糖化糖胺聚糖的结构研究概况... 6

1.3 海参硫酸化多糖的活性研究... 8

1.3.1 免疫调节活性... 8

1.3.2 抗凝血活性... 9

1.3.3 其他生物活性... 10

1.4 选题意义与研究内容... 10

第2章 球参多糖的提取、分离纯化与理化性质分析... 12

2.1 实验材料和仪器... 12

2.1.1 实验材料... 12

2.1.2 实验试剂... 12

2.1.3 实验仪器... 13

2.2 实验方法... 13

2.2.1 球参粗多糖的提取... 13

2.2.2 球参多糖的分离纯化... 14

2.2.3 球参多糖的理化性质分析... 15

2.2.4 球参多糖的纯化... 19

2.3 结果与分析... 19

2.3.1 球参粗多糖的提取... 19

2.3.2 球参多糖的分级与理化性质分析... 19

2.3.3 球参多糖的纯化... 23

2.4 小结... 24

第3章 岩藻糖化糖胺聚糖FG的结构表征与生物活性研究... 26

3.1 实验材料和仪器... 26

3.1.1 实验材料... 26

3.1.2 实验试剂... 26

3.1.3 实验仪器... 27

3.2 实验方法... 27

3.2.1 FG的NMR分析... 27

3.2.2 FG的降解... 27

3.2.3 dFG的纯化... 28

3.2.4 dFG的NMR分析... 28

3.2.5 FG及dFG的抗凝血活性评价... 28

3.2.6 FG及dFG的免疫调节活性评价... 29

3.3 结果与分析... 30

3.3.1 FG的核磁共振分析... 30

3.3.2 FG的β-消除结果及HPLC分析... 30

3.3.3 dFG的核磁共振分析... 31

3.3.4 FG及dFG的体外抗凝血活性研究... 36

3.3.5 FG及dFG的免疫调节活性研究... 39

3.4 小结... 41

第4章 岩藻聚糖硫酸酯FS的结构表征与免疫调节活性研究... 42

4.1 实验材料与仪器... 42

4.1.1 实验材料... 42

4.1.2 实验试剂... 42

4.1.3 实验仪器... 43

4.2 实验方法... 43

4.2.1 FS的NMR分析... 43

4.2.2 FS的降解... 43

4.2.3 dFS的纯化... 43

4.2.4 dFS的NMR分析... 44

4.2.5 细胞培养... 44

4.2.6 FS及dFS的免疫调节活性... 45

4.3 结果与分析... 46

4.3.1 FS的核磁共振分析... 46

4.3.2 TFA降解FS结果及HPLC分析... 47

4.3.3 dFS的核磁共振分析... 47

4.3.4 FS及dFS的免疫调节活性... 51

4.4 小结... 54

第5章 结论与创新点... 55

5.1 结论... 55

5.2 创新点... 55

参考文献... 57

致谢... 66

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果    67