斑石鲷（Oplegnathus punctatus）主要分布于西太平洋温热带海域，2014年，我国首次成功突破了斑石鲷生殖调控和苗种全人工繁育技术，将其纳入海水网箱和工厂化养殖的重要对象，是我国重要的新型海水经济鱼类。目前，斑石鲷的市场销售价格已达到每斤200元，其养殖经济效益显著。作为我国本土自然种类，斑石鲷的资源开发及可持续利用具有长期重要意义。斑石鲷具有雌雄生长二态性，雄性个体显著大于雌性个体；雄鱼染色体中存在一条巨大的染色体，具有复性染色体系统（X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y）。目前有关性别决定的研究集中于XX/XY，ZZ/ZW的标准性染色体系统，对于复性染色体系统（X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y）的性别决定及分化机制缺乏系统研究。由此，提出以下科学问题：①斑石鲷的异型染色体是不是性染色体？如何鉴定斑石鲷的性染色体；②斑石鲷复性染色体系统是如何进行性别决定的，性别决定基因是什么？③斑石鲷的性别分化通路与其他性染色体系统相比有何不同？

本研究以斑石鲷为研究对象，围绕具复性染色体系统斑石鲷的性染色体鉴定、性别决定基因的挖掘与筛选、性别决定机制以及性别分化机制展开研究，旨在探究斑石鲷复性染色体系统的性别决定及性别分化机制，为复性染色体系统（X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y）鱼类的性别决定与分化调控机制提供关键证据，补充具融合染色体（Y）X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y系统鱼类的性别决定与性别分化理论，为鱼类性别控制与育种工作提供理论支撑，对研发具雄性优势生产性状的斑石鲷苗种制种技术体系的构建具有重要意义。具体的研究结果如下：

1. 斑石鲷的性染色体识别与鉴定

性染色体在复性染色体系统中往往表现出显著的形态特征和染色体结构变异（插入、缺失、倒位、重复或重排），且携带着性别决定基因。为明确斑石鲷的异型染色体与性别之间的关联性，鉴定斑石鲷性染色体，本研究通过斑石鲷的染色体核型、生理性别以及遗传性别标记鉴定开展异型染色体与斑石鲷性别的关联性分析。染色体核型结果显示雄性斑石鲷具有一条巨型中心着丝粒异型染色体，核型为2n=47，1m+2sm+44t，NF=50；雌性斑石鲷核型为2n=48，2sm+46t，NF=50。具有异型染色体的斑石鲷性腺均为精巢，且性别标记鉴定结果均显示具有雄性特异性条带，斑石鲷异型染色体与雄性性别100%对应。基于PacBio CCS高通量测序和Hi-C染色体组装挂载结果也证明了斑石鲷雌鱼染色体为48条，雄鱼为47条；且雄鱼1号染色体（异型染色体）发生了染色体融合事件，共线性结果显示雄鱼的融合异型性染色体（MChr1）与雌鱼3号和8号染色体为同源染色体，且发生大片段倒位形成了重组抑制区，进一步证实雄鱼融合染色体（MChr1）为斑石鲷雄性性染色体。

为便于深入研究斑石鲷的性别分化与性别决定基因，迅速探知斑石鲷样本的遗传性别，基于amhr2基因，通过基因组序列比对序列分析，根据差异区段设计引物获取了斑石鲷性别特异性标记。结果表明，雄性斑石鲷具有两段条带，雌性斑石鲷只有一条带，雌雄性斑石鲷共有条带长318 bp，雄性特异性条带长191 bp，雄性amhr2序列相对雌性缺失121 bp。性别标记可以有效鉴定斑石鲷的遗传性别，特异性强、操作简单，为斑石鲷遗传育种提供了可行方法。

2. 斑石鲷性别分化关键期及dmrt1性别分化调控

为了明确斑石鲷性别分化关键期，确定斑石鲷高雄苗种制备人工诱导的时机，本研究从雌雄性腺mRNA和激素二态性表达以及性腺发育组织学二态性差异三个层面开展了斑石鲷性别时序分化关键期确定研究。针对斑石鲷发育时序样本（5 -360 dph），参考斑石鲷雌雄性腺基因组差异表达基因基筛选的性别分化基因集，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）探究斑石鲷mRNA水平性别分化期。结果显示，在35 dph，雌（foxl₂，cyp19a，cyp19b）雄（dmrt1，sox9a，sox9b，amh，amhr2，hsd11b₂）性别分化标记基因在mRNA水平上呈现稳定的雌雄二态性表达差异；酶联免疫ELISA研究结果显示60 dph时，雄性斑石鲷性腺的11-KT（11-ketotestosterone）含量显著高于雌性，70 dph时雌性性腺的E₂含量显著高于雄性，在激素水平表现出显著的雌雄二态性表达特征；性腺发育时序组织学结果显示90 dph时雌性斑石鲷出现卵巢腔，100 dph时，雄性斑石鲷出现输精管，明确斑石鲷生理水平性别分化完成。

雄性性别分化标记基因dmrt1呈现显著的雌雄性腺表达二态性，可能在性别分化中发挥重要功能。本研究通过全基因组扫描深入探讨了斑石鲷dmrt家族成员及演化过程，通过性腺RT-PCR实验、原位杂交及性腺细胞dmrt1-dsRNA干扰实验深入探讨了斑石鲷的性别分化调控通路。斑石鲷dmrt基因家族存在7个成员，分别对应索脊动物四个dmrt祖先基因亚家族类群（dmrt4/5、dmrt2a/2b、dmrt93b和dmrt1/6），研究揭示斑石鲷dmrt基因家族经过了三轮染色体复制事件（3R）才形成当前的染色体排布模式。Dmrt1基因在精巢中的次级精母细胞、初级精母细胞以及间质细胞中表达，且dmrt1基因敲降没有导致斑石鲷雄性相关基因的下调，反而使得与雄性分化密切相关基因（sox9a、sox9b、amh、amhr2）以及雄激素合成关键基因hsd11b2发生显著的上调表达趋势，研究结果进一步支持了amhr2作为性别决定基因的推论，并首次提出在具X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y系统中位于雄性异型性染色体Y上的amhr2/amh系统驱动雄性分化和维持雄激素合成的主效通路。

3. 斑石鲷性别决定基因挖掘

本研究通过采用全基因组扫描、基因组重测序群体进化选择清除分析、GWAS分析以及性腺转录组，多组学联合方法构建了斑石鲷的性别决定基因候选基因集。我们共筛选出6个性别关联异型染色体定位基因（amhr2， wnt4， wnt7b， cyp19b， wt1a， wnt7a）、212个雌雄差异表达基因、1691个受到正选择位点（P<0.05）和3392个性别相关基因（P<0.05）。通过取三种组学分析基因集的交集，共筛选获得了4个位于雄鱼异型染色体（MChr1）的性别特异性基因：amhr2，wnt4，gdf11，aldh1l2。基于实时荧光定量PCR对斑石鲷发育时序及组织特异性样本研究结果显示，amhr2主要在斑石鲷性腺中特异性表达，其中精巢的表达量显著高于卵巢；wnt4特异在卵巢表达；gdf11和aldh1l2在多种组织（眼、脑、肠）中表达。研究进一步显示在35 dph位于雄性斑石鲷异性染色体上的amhr2基因表达量显著高于雌性斑石鲷，此后表达量持续稳定升高。上述研究表明，amhr2基因是斑石鲷最佳的雄性性别决定候选基因。

4. 斑石鲷性别调控网络及决定机制研究

本研究通过全基因组扫描，明确了amhr2基因在不同鱼类的进化关系，发现了amhr2基因雌、雄转录二态性模式。通过实时荧光定量技术、蛋白质模型预测以及分子对接技术对不同转录模式下的amh/amhr2结合效率（受体/抗体）进行了量化评估。在此基础上，我们采用斑石鲷性腺细胞的RNAi技术和幼鱼基因过表达技术对amhr2基因的性别决定机制进行了验证研究。基于三代全长转录CCS高通量测序分析发现，雄性斑石鲷amhr2基因存在三种形式的转录本分别为amhr2ay、amhr2by、amhr2cy，而斑石鲷雌性仅具有1种转录本（amhr2a）且跟雄性amhr2ay高度一致（91.6%）。受体/抗体结合效率评估结果发现，雄性Amhr2cy蛋白胞外区结构域与Amh蛋白的结合能力最强；RT-PCR结果进一步显示amhr2 mRNA在精巢呈现特异表达，且amhr2cy可变剪切体的表达量最高，从5 dph起最早显示出雌雄表达差异。RNAi及基因过表达功能验证实验表明：amhr2基因的敲降导致了斑石鲷雄性相关基因（dmrt1、amh、sox9a、sox9b）及雄激素合成关键基因（hsd11b2、cyp11a、cyp11a）表达量呈现系统性下降模式，并且促进了雌性相关基因（wnt4、foxl2、cyp19a、cyp19b）的表达；而amhr2基因过表达则能显著促进雄性相关基因及雄激素合成关键基因的表达，对雌性相关基因也有促进作用。

综上所述，由于斑石鲷amhr2基因存在雌、雄转录二态性模式，使得amhr2基因的转录本数量、mRNA表达量以及amhr2受体与amh配体蛋白结合效率呈现显著雌雄二态性差异，进而产生的级联剂量（剂量补偿）效应导致了雌雄性别分化的不同命运。RNAi及基因过表达首次证实amh/amhr2系统位于斑石鲷雄性性别调控通路上游，雄性斑石鲷amhr2具有3个mRNA转录本（amhr2ay、amhr2by、amhr2cy），雌鱼中只有1个转录本（amhr2a），产生的剂量补偿效应使得斑石鲷在雄性性别分化关键期（35 dph-60 dph），精巢中amhr2的呈现高水平的表达趋势，可能进一步提升了雄性相关基因的高表达（sox9b、dmrt1），实现了雄性激素合成关键基因hsd11b2的高表达，进而促进了睾酮向11-KT的转化，进而促进了斑石鲷在分化关键期向雄性方向分化，基于本研究结果结合经典的动物雄性性别调控通路构建了以斑石鲷为代表的X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y系统鱼类性别分化调控网络。