仿刺参Apostichopus japonicus，又名刺参，是我国重要的海洋经济物种，隶属棘皮动物门海参纲，后口动物，是无脊椎动物中与脊索动物最为相似的类群，占据特殊分类地位。仿刺参在经历刺激、环境胁迫等不利条件时，在神经调控下遵循固定的模式发生吐脏再生现象，消除了人工损伤导致的个体差异性，保持了再生的同步性和重现性，因此，仿刺参肠道再生是探究单个器官生成的良好模型。目前已明确肠道再生分为伤口愈合、原基形成、肠腔形成、肠道分化与生长五个阶段，再生14天时肠腔完全连通成肠管，完成新肠道生成。仿刺参吐脏后，食道残基与撕裂的肠系膜是再生起点，但大多数研究聚焦于肠系膜再生过程的变化，而忽视了残基端响应损伤及启动再生的特征。

本研究以健康正常仿刺参肠道为对照组，以再生6小时、1天、3天和7天的新生肠道为实验组，基于石蜡切片和透射电镜切片观察伤口愈合期和原基形成早、中、晚期肠道的组织细胞学特征。通过转录组测序探究吐脏后的伤口愈合期（再生6小时）及启动再生期（再生1天、3天和7天）组织水平的基因表达变化。基于10× Genomics scRNA-seq技术构建不同再生时间的肠道原基细胞谱系，明确再生原基的细胞异质性，筛选存在潜在分化关系的细胞类群并进行细胞分化轨迹分析。基于组织细胞学和bulk RNA-seq结果，联合单细胞数据，筛选仿刺参再生相关特异表达基因，继而开展下游功能验证实验，拟查明仿刺参再生关键基因的调控功能，最终明确再生原基细胞的演化特征及相关驱动因子。具体研究结果如下：

1、仿刺参肠道再生原基的组织细胞学特征

对吐脏后的仿刺参肠道断裂面进行H&E染色以观察组织结构变化，结果显示：再生6小时的肠道未见明显的组织层变化，肌肉层变薄，粘膜层出现空泡状结构；再生1天的肠道横切面中看不到明显的肌肉层，结缔组织降解；再生3天的肠道原基愈合成盲端，与肠系膜相连，未见明显的组织层分化；再生7天的新生肠道开腔部分可见肠壁组织层分化，由内到外为粘膜层-结缔组织-体腔上皮层，粘膜层已分化出多种细胞类型，在结缔组织中可见正在迁移的细胞。透射电镜观察到肌上皮细胞去分化，再生肠上皮中，神经内分泌样细胞的分泌颗粒增多。利用EdU和DAPI对增殖细胞和所有细胞进行标记，结果表明：正常肠道和再生6小时肠道几乎无正在增殖的细胞；再生1天肠道中存在零星的增殖细胞，主要分散在粘膜层；再生3天肠道中增殖细胞分散分布在粘膜层和体腔上皮层；再生7天的增厚肠系膜原基中，增殖细胞遍布体腔上皮层和内部结缔组织。利用TUNEL染色标记凋亡细胞，发现在正常肠道的体腔上皮和肠腔上皮分布有少量凋亡细胞；仿刺参吐脏后至再生3天时，凋亡持续增加；再生7天的增厚肠系膜原基中，凋亡细胞遍布体腔上皮层，结缔组织中有少量分布；在再生7天的肠道开腔部位，仅有少量凋亡细胞存在于粘膜层。说明凋亡现象遍布再生原基体腔上皮，但在肠道开腔后结束，凋亡是起始再生的重要事件。

2、仿刺参响应应激及启动肠道再生时组织水平的转录调控特征

为探究仿刺参吐脏后肠道响应应激及启动再生的基因表达特征，对正常肠道，再生6小时、1天、3天和7天的新生肠道进行转录组测序。差异基因的功能富集分析结果表明钙离子和神经活性配体-受体参与损伤信号传递，VP/OT型神经肽信号系统可能在仿刺参肠道伤口愈合阶段起重要调控作用。早期伤口愈合和启动再生过程中发生的主要分子事件是自噬、去粘附、迁移和关闭摄食信号。仿刺参特化再生基因家族AjPSP94有15条串联重复基因，AjPSP94-10在对照组表达量最高，AjPSP94-7在再生1天时表达量最高，其余AjPSP94基因均在再生6小时高表达，随后表达量下降。加权基因共表达网络分析结果表明，AjPSP94-2、AjPSP94-3、AjPSP94-4、AjPSP94-6、AjPSP94-9、AjPSP94-12、AjPSP94-13、AjPSP94-15与伤口愈合期（再生6小时）高度相关。

3、肠道原基细胞异质性

通过单细胞转录组测序，构建了正常肠道与再生肠道的单细胞图谱，基于各细胞类群的基因表达特征，鉴定到成纤维细胞、上皮细胞、间充质细胞、神经细胞、内皮细胞、巨噬细胞、神经内分泌细胞、神经胶质细胞、肌细胞、肠上皮细胞、免疫细胞等细胞类型。发现仿刺参特有的再生基因家族AjPSP94-like特异性表达于伤口愈合期和再生1天、3天的肠道上皮细胞，利用拟时序分析揭示了上皮细胞的潜在干细胞特性。为探究调控上皮细胞活动的神经信号来源，分析发现色素分散因子（pigment-dispersing factor-like precursor, PDF）基因在再生样本的神经内分泌细胞中显著表达。对PSP94-11、PSP94-12以及神经内分泌细胞的特征基因NC2和PDF进行多克隆抗体制备，蛋白免疫印记结果显示PDF蛋白在再生1天、3天、7天的表达量逐渐升高，且PSP94的蛋白表达量也呈现逐渐升高的趋势。在正常肠道中，神经内分泌细胞分布在体腔上皮层，在再生时期向结缔组织迁移。PSP94-12蛋白在正常肠道中主要表达在体腔上皮层，吐脏后迅速响应，在各组织层均有分布。可能是由于损伤导致的神经信号快速应答，从而调控了PSP94基因的上调表达，进而启动了上皮细胞的分化过程。

4、PDF神经肽调控上皮细胞中PSP94-like基因家族参与上皮间充质转化

PDF基因编码两条PDF成熟肽，为进一步探究PDF神经肽在再生原基的功能，鉴定了仿刺参中PDF的功能受体，系统解析了受体基因的分子特征、神经肽与受体的信号传递。仿刺参基因组中两条PDFR均含有7tmB1_PDFR结构域，通过亚细胞定位明确两个受体均表达在细胞膜上。对PDFR的系统发育分析显示，仿刺参的PDFR1和PDFR2均与玉足海参中PDFR聚为一支。成熟肽PDF1/2均能激活PDFR2并引起受体内吞，导致胞内cAMP积累。PDF1/2结合PDFR2激活了MAPK信号级联途径，提高了ERK1/2磷酸化水平，并呈浓度依赖，同时通过抑制AKT磷酸化调控PI3K-AKT信号通路。通过注射siRNA和成熟肽以减少或增加PDF神经肽在体内的含量，发现PDFR2的基因表达变化与PDF神经肽含量的变化保持一致。同时，本研究还观察到与伤口愈合阶段高度相关的AjPSP94基因表达发生了变化，且其表达模式与PDFR2的变化一致，表明PDF神经肽激活PDFR2，并进一步通过胞内信号传递途径调控了PSP94基因的表达。

第1章 绪论 1

1.1 动物再生       1

1.1.1 动物再生模式    1

1.1.2 再生细胞来源    2

1.2 棘皮动物再生的研究进展   3

1.2.1 细胞与分子机制 3

1.2.2 神经信号在棘皮动物再生中的研究      4

1.3 海参肠道再生的研究进展   5

1.3.1 吐脏后的早期事件    6

1.3.2 再生关键基因    8

1.4 研究目的、意义及研究思路      11

1.4.1 研究背景与科学问题       11

1.4.2 研究目的与意义 12

1.4.3 技术路线    12

1.4.4 预期成果    13

第2章 仿刺参肠道再生原基组织细胞学特征      15

2.1 研究背景       15

2.2 材料与方法   16

2.2.1 动物处理与样品采集       16

2.2.2 石蜡切片及H&E染色      16

2.2.3 透射电镜切片观察    16

2.2.4 EdU细胞增殖检测     16

2.2.5 TUNEL细胞凋亡染色 17

2.3 实验结果       17

2.3.1 肠道再生初期组织结构变化   17

2.3.2 肠道再生初期细胞学变化       19

2.3.3 肠道再生初期细胞增殖情况   20

2.3.4 细胞凋亡特征    21

2.4 讨论 23

2.4.1 仿刺参启动肠道再生的组织细胞学事件      23

2.4.2 细胞增殖及凋亡在肠道再生初期的作用      24

2.5 本章小结       25

第3章 肠道再生原基的转录调控特征   27

3.1 研究背景       27

3.2 材料与方法   28

3.2.1 实验材料与样品采集       28

3.2.2 文库构建及测序 28

3.2.3 参考基因组比对及基因表达定量   29

3.2.4 基因差异表达分析    29

3.2.5 WGCNA分析      29

3.2.6 GO和KEGG功能富集分析      29

3.2.7 特征基因的热图分析       29

3.2.8 AjPSP94基因家族的鉴定及基因结构分析    30

3.3 实验结果       30

3.3.1 转录组测序概况 30

3.3.2 差异表达基因分析    32

3.3.3 差异表达基因的功能富集分析       33

3.3.4 加权基因共表达网络分析       41

3.3.5 目标模块及hub基因筛选      43

3.3.6 AjPSP94基因结构及表达特征 44

3.4 讨论 45

3.4.1 多种神经信号参与仿刺参肠道伤口愈合      45

3.4.2 关键生物学过程在肠道再生初期的表达模式       46

3.4.3 肠道再生初期的基因响应特征       47

3.5 本章小结       48

第4章 基于scRNA-seq解析仿刺参肠道再生的细胞异质性       49

4.1 研究背景       49

4.2 材料与方法   50

4.2.1 样品采集与单细胞悬液制备   50

4.2.2 10× Genomics文库构建与测序      50

4.2.3 数据质控、过滤及参考基因组比对      50

4.2.4 细胞分群及细胞类型注释       51

4.2.5 拟时序分析 51

4.2.6 关键基因免疫组化验证    51

4.3 实验结果       52

4.3.1 单细胞转录组测序质控结果   52

4.3.2 仿刺参肠道再生初期单细胞图谱   53

4.3.3 细胞类型鉴定    56

4.3.4 细胞分化轨迹分析    59

4.3.5 再生关键基因的表达特征       61

4.4 讨论 64

4.4.1 仿刺参肠道细胞类型多样性   64

4.4.2 AjPSP94-like基因家族是上皮细胞的主效基因       65

4.5 本章小结       65

第5章 PDF神经肽对肠道再生原基的调控特征   67

5.1 研究背景       67

5.2 材料与方法   68

5.2.1 序列特征及系统发育分析       68

5.2.2 体内神经肽注射 68

5.2.3 RNAi实验    68

5.2.4 总RNA提取及反转录      69

5.2.5 实时荧光定量PCR    69

5.2.6 PDFR(1/2)-EGFP和PDFR(1/2)-pcDNA3.1(+)表达载体构建及质粒扩增  69

5.2.7 HEK293细胞复苏及培养  70

5.2.8 细胞瞬时转染及荧光染料染核和染膜   70

5.2.9 蛋白免疫印记分析    70

5.2.10 cAMP含量检测       71

5.3 实验结果       71

5.3.1 PDF及PDFR序列特征与系统发育分析 71

5.3.2 PDF-RNAi结果   73

5.3.3 体内注射PDF成熟肽对PDFR及AjPSP94基因表达的影响      74

5.3.4 PDF1/2引起PDFR2受体内吞  75

5.3.5 PDF1/2激活PDFR2介导胞内cAMP积累和蛋白磷酸化       78

5.4 讨论 80

5.4.1 PDF1/2激活PDFR2   80

5.4.2 PDF1/2可能调控肠道再生      82

5.5 本章小结       82

第6章 总结与展望    83

6.1 研究总结       83

6.2 主要创新点   84

6.3 存在问题       84

6.4 研究展望       84

参考文献       87

附录一  用于RNAi和RT-PCR的引物   105

附录二  mRNA数量、表达量、线粒体RNA比例的QC小提琴图   106

致  谢   107

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果   109