我国南海珊瑚礁区地处热带-亚热带地区，生物多样、资源丰富，近年来因全球气候变化、人为营养富集、过度捕捞等问题而陷入退化危机。自由生活海洋线虫是后生动物中的优势类群，其摄食活动和新陈代谢能够促进生态系统物质循环，常被用于评估生态系统健康和海洋环境污染程度。同时海洋线虫作为珊瑚礁生态系统的重要组成部分，其生物多样性也因珊瑚礁危机而遭到破坏。目前针对我国南海珊瑚礁地区的海洋线虫研究相对较少，这一区域海洋线虫种类与分布情况尚不清楚。有关海洋线虫的分类学研究主要围绕传统形态学分析、DNA条形码分析、环境DNA宏条形码分析展开。但是由于海洋线虫体型小且培养困难，基于这些分析方法能够获取的分子生物学信息十分有限。为进一步明确我国南海珊瑚礁地区海洋线虫的生物多样性与分类学地位，本研究围绕海南、中北暗沙及西沙、南沙进行了34个站位的沉积物采集。一方面通过沉积物环境DNA分析初步调查海洋线虫的群体结构，另一方面通过沉积物单线虫分离鉴定来补充海洋线虫物种信息，将两种结果互相结合从而分析我国南海珊瑚礁区海洋线虫的生物多样性及分布情况。与此同时，利用模式生物秀丽隐杆线虫，摸索出适用于单条沉积物海洋线虫全基因组扩增的实验路线，针对此次沉积物分离出的11科22属共28个个体的海洋线虫进行全基因组扩增并首次完成基因组调查。最后基于18S rRNA序列信息，对本次南海珊瑚礁区沉积物分离的海洋线虫进行系统发育关系分析。主要研究结果包括以下几部分：

1. 海南、中北暗沙及西沙、南沙海洋线虫生物多样性

（1）针对海南、中北暗沙及西沙、南沙珊瑚礁地区共34个站位的沉积物，通过环境DNA分析一共鉴定出海洋线虫2纲11目62科100属。三个海域线虫纲水平全部为色矛纲（Chromadorea）与刺嘴纲（Enoplea）。其中线虫目水平主要为小杆目（Rhabditida）；线虫科水平主要为头叶科（Cephalobidae）与孔咽科（Aporcelaimidae）；线虫属水平主要为丽突属（Acrobeles）与孔咽属（Aporcelaimellus） 。

（2）针对海南、中北暗沙及西沙、南沙珊瑚礁地区沉积物进行单线虫分离，共鉴定海洋线虫366条，分属于2纲8目19科45属（含4个未鉴定属）57种（或分类实体）。优势属为伪线属（Pseudonchus）、阿顿嘉属（Adoncholaimus）、折咽属（Ptycholaimellus）、美色属（Euchromadora）与新色矛属（Neochromadora）等。

（3）两种方法鉴定结果差别比较大，其中重合部分共计2纲8目14科8属。综合两种方法的鉴定结果，海南、中北暗沙及西沙、南沙珊瑚礁地区最终鉴定出海洋线虫2纲11目67科137属（含4个未鉴定属）。

2. 海南、中北暗沙及西沙、南沙海洋线虫分布特点

（1）在沉积物环境DNA分析工作中，南沙的海洋线虫物种丰富度最高，海南的物种丰富度最低；中北暗沙及西沙的群落分布均匀程度最高，海南群落分布均匀度最低；海南与中北暗沙及西沙的线虫群落组成更为相似。其中海南优势属为Litomosoides属、Tylenchus属；中北暗沙及西沙优势属为Poikilolaimus属、Criconemoides属；南沙优势属为Tarvaia属、Monoposthia属、Filenchus属、Longidorus属、Haliplectus属、Discocriconemella属、Teratodiplogaster属等。三片海域的共有优势属为Acrobeles属及Aporcelaimellus属。

（2）在单线虫分离鉴定工作中，中北暗沙ZS13站位，以及南沙的AD、DM、Y6站位鉴定出5种及5种以上海洋线虫。西沙YZ、南沙ZX及CG站位的沉积物没有分离出海洋线虫。其余站位大部分都鉴定出了2~4种海洋线虫。其中Adoncholaimus sp.、Pseudonchus sp.、Epacanthion sp.、Viscosia sp.、Acanthopharynx sp.、Axonolaimus sp.、Catanema sp.、Desmodora sp.、Euchromadora sp.、Neochromadora sp.、Prochaetosoma sp.在5个及5个以上站位中均出现了分布。

3. 海南、中北暗沙及西沙、南沙海洋线虫全基因组扩增及系统发育关系

（1）摸索出适用于沉积物单条海洋线虫的全基因组扩增方法。基于沉积物分离得到的海洋线虫，从中选择不同科、同科不同属的个体进行全基因组扩增，共计2纲7目11科22属（包含1个未分类属）28种（或分类实体）。通过全基因组数据首次获取了这些海洋线虫的COI序列信息（1000bp左右），并首次完成基因组调查。

（2）对南海珊瑚礁区全基因组扩增的海洋线虫个体进行系统发育关系分析，结果显示链环科（Desmodoridae）、色矛科（Chromadoridae）与希阿利科（Xyalidae）是单系群，刺嘴科（Enoplidae）与瘤科（Oncholaimidae）的亲缘关系最近。

综上，针对海南、中北暗沙及西沙、南沙海洋线虫的种类、分布与系统发育关系分析，为厘清南海珊瑚礁区海洋线虫生物学信息提供了基础数据。针对沉积物中单条海洋线虫全基因组扩增提出了完整实验路线，这一工作弥补了海洋线虫传统形态分类方法的不足，为海洋线虫分子生物学分析提供了重要的实验方法和参考依据，有关海洋线虫的全基因组测序数据对于填补海洋线虫数据库空白以及促进海洋线虫分子生物学发展具有重要意义。这一实验路线对于海绵、珊瑚、藻类等不易采集、样品量少和提取DNA困难的生物研究工作同样具有参考意义。本工作为南海珊瑚礁区生态系统生物多样性保护、生物资源合理利用提供了科学依据。

第1章 绪论    1
1.1 珊瑚礁概述    1
1.1.1 珊瑚礁介绍    1
1.1.2 珊瑚礁生态危机    1
1.1.3 南海珊瑚礁介绍    2
1.2 海洋线虫概述    2
1.2.1 海洋线虫介绍    2
1.2.2 海洋线虫研究概况    3
1.2.3 我国海洋线虫研究现状    4
1.3 分子生物学研究方法概述    4
1.3.1 DNA条形码技术    4
1.3.2 环境DNA宏条形码技术    4
1.3.3 全基因组扩增测序技术    5
1.4 研究内容、目的及技术路线    7
第2章 海洋线虫群落结构与物种分布调查    9
2.1 材料与方法    9
2.1.1 样品采集    9
2.1.2 实验仪器、试剂及方法    10
2.1.3 DNA提取与高通量测序    10
2.2 结果    11
2.2.1 有效序列及OTUs    11
2.2.2 OTUs物种分类学信息注释    12
2.2.3 海洋线虫物种相对丰度    16
2.2.4 海洋线虫群落组成与分析    18
2.2.5 Alpha多样性分析    19
2.2.6 海域间差异显著性分析    21
2.3 讨论    22
2.3.1 海洋线虫生物分类学    22
2.3.2 海洋线虫群落结构差异    23
2.4 小结    23
第3章 海洋线虫生物多样性分析    25
3.1 材料与方法    25
3.1.1 样品处理    25
3.1.2 实验仪器、试剂及方法    25
3.1.3 单线虫分离与裂解    26
3.1.4 海洋线虫种类鉴定    26
3.2 结果    26
3.2.1 海洋线虫鉴定结果统计    26
3.2.2 海洋线虫分布情况统计    30
3.3 讨论    31
3.3.1 环境DNA分析与单线虫分离鉴定    31
3.3.2 海洋线虫生物多样性    32
3.3.3 海洋线虫物种分布及优势种属信息    32
3.4 小结    33
第4章 海洋线虫全基因组扩增及系统进化关系分析    35
4.1 材料与方法    35
4.1.1 沉积物处理    35
4.1.2 全基因组扩增实验方法优化    35
4.1.3 全基因组扩增及系统发育分析    35
4.2 结果    37
4.2.1 沉积物不同处理方式的比较    37
4.2.2 全基因组扩增实验方法探索    37
4.2.3 基因组调查及数据分析    38
4.2.4 海洋线虫系统发育关系分析    41
4.3 讨论    43
4.3.1 单条沉积物海洋线虫的全基因组扩增方法    43
4.3.2 基于全基因组扩增的海洋线虫基因组分析    43
4.3.3 海洋线虫线粒体基因组组装初步尝试与分析    44
4.3.4 南海珊瑚礁区海洋线虫系统进化关系    44
4.4 小结    44
第5章 总结与展望    47
5.1 研究结论    47
5.2 创新、不足与展望    48
参考文献    49
致 谢    57
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果    59