气候变化正在导致海洋水体的温度升高和溶解氧含量降低，这一现象在半封闭水体中尤为明显。位于中国南海（South China Sea）的西沙永乐龙洞（Yongle blue hole, YBH）是世界上最深的蓝洞，其中半封闭条件下形成的独特生态系统，使其成为研究无氧区形成、物种演化、生物地球化学循环和生物适应性的绝佳场所。洞内约200 m深的稳定存在的无氧水体富含硫化氢和甲烷，具有大量的新颖微生物。其中微生物的来源和独特性、对海洋表层物质循环的贡献还没有得到充分研究。

本研究中，我们利用原位微生物过滤和固定（in situ microbial filtration and fixation，ISMIFF）装置分别在两个航次中，采集了永乐龙洞16个春季和5个秋季的共21个水层的微生物样品。基于来自春季样品的宏基因组数据，提取了16S rRNA基因片段进行原核微生物群落结构分析。结果显示缺氧层中未分类原核微生物的百分比较高（平均为38%），并且微生物组新颖性显著高于其他海洋氧气最小区。相比起传统采样方法，原位采样可以收集种类更多的微生物。在缺氧层中，硫化物浓度是驱动永乐龙洞微生物群落分化的最重要因素，这支持了以脱硫菌门（Desulfatiglandales，约占17.96%）为主导的硫酸盐还原细菌在缺氧层的广泛存在。

基于上述两个航次样品，从获得的21个宏基因组和11个宏转录组中提取了18S rRNA基因片段，以分析真核微生物的群落结构。好氧区的真核微生物的多样性和丰富度高于低氧区和缺氧区。基于18S rRNA序列V9区域的分类比例，主要的优势物种是甲藻纲（Dinophyceae）和颚足纲（Maxillopoda），其相对丰度呈现不均匀的垂直分布，这种丰度差异可能与温盐跃层边界和有氧-缺氧界面有关。以甲藻纲为主的真核微型藻类群落在洞内的20 m（20.01％）和105 m（26.13％）水层中最为丰富。颚足纲在40 m（22.84％）、80 m（23.19％）和100 m（15.42％）水层中占优势。这些区域中的颚足纲幼虫和原生生物可能是捕食那些在温盐跃层边界和有氧-缺氧界面处高丰度的化能自养细菌的主要种群。

本研究获得了318个原核微生物的宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes，MAGs）。通过对这些基因组在样品中的相对丰度分析，我们发现了不同氧含量水层之间微生物的分布差异。对基因组和功能基因的分析表明，永乐龙洞的甲烷可能来源于微生物降解甲基膦酸盐（methylphosphonate, MPn）和二甲基巯基丙酸内盐（dimethylsulfoniopropionate, DMSP）。甲烷氧化可能主要由低氧和缺氧环境中参与甲烷氧化的新型甲烷氧化菌Planctomycetota、Bacteroidota和Verrucomicrobiota完成，阻止了永乐龙洞向外界水体释放甲烷。其中，Bacteroidota新种介导的甲烷氧化作用消耗了无氧层约77%的甲烷，而好氧层的甲烷主要由Methylococcales消耗。此外，永乐龙洞无氧区主要通过Wood-Ljungdahl（WL）途径进行暗碳固定。来自Thermoproteota门的氨氧化古菌主要在好氧层和低氧层进行化能自养，并与属于Nitrospinota门的亚硝酸盐氧化细菌一同参与硝化过程。厌氧氨氧化细菌Canditatus Scalindua在低氧层中是重要的菌群，通过厌氧氨氧化作用导致了龙洞内氮的流失。通过分析固氮酶复合体的nif基因簇，我们发现了Desulfobacterota和Planctomycetota等固氮菌在缺氧条件下可能具有固氮的潜力。此外，硫酸盐还原细菌Desulfobacterota在无氧区占主导地位，负责硫酸盐的还原过程。而上溢的硫化氢在有氧区和低氧区被Thiomicrorhabdus和SUP05等物种消耗，阻止了硫化氢从龙洞溢出。

本研究还发现了3种龙洞蓝细菌，包括两个在黑暗无氧环境下基因活跃表达的蓝细菌。这些蓝细菌与光照有氧环境中的海绵共生蓝细菌具有相似的基因组特征，表明其潜在的海绵共生特征，这可能与它们在沉入龙洞之前在海绵体内的共生生活方式相关。此外，研究还发现无氧区蓝细菌基因组含有独特的适应性基因，其中含有编码鼠李糖合成酶的基因，暗示了自由光合生活方式的转变。基因组中抗氧化应激基因的减少，表明了蓝细菌在黑暗的深层水体中可能减少了对抗氧化应激功能的需求。另外，在这些蓝细菌基因组中发现了牛磺酸转运蛋白，这表明了它们具有利用海绵代谢的有机硫废物的潜力。总之，无氧区蓝细菌具备与有氧环境中共生蓝细菌相似的特征，还显示出了向自由生活状态过渡的倾向，并且表现出了对无氧环境的适应能力，这有助于我们理解缺氧海域中微生物的适应机制及物种演化。

总之，本研究对独特的半封闭蓝洞环境中的原核和真核微生物进行了深入分析，揭示了它们的分类学新颖性和在生态系统中的角色。研究表明，这些微生物通过复杂的生物地球化学过程，对碳、氮、硫等元素的循环起到了推动作用，这为理解类似海洋环境中复杂的元素循环过程提供了新的科学数据。本研究还推测了永乐龙洞内微生物介导的甲烷循环途径，为理解全球气候变化背景下的海洋甲烷循环机制提供了新视角，增进了对海洋蓝洞及其他海洋凹陷区域甲烷积累与排放过程的理解。此外，本研究在黑暗无氧环境中发现的海绵共生微生物亲缘种，不仅丰富了我们对海洋微生物多样性和新种来源的认识，也为探索微生物在新环境下的适应机制提供了宝贵的线索。这些发现对于预测和评估气候变化对全球海洋生态系统功能的影响具有重要意义，有助于深化我们对全球类似无氧海洋环境中微生物生存和适应策略的科学理解。