MAPK/ERK 信号通路对菲律宾蛤仔血淋巴细胞胞外陷阱的形成及调控机制研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 吕晓静 |
| 答辩日期 | 2024-11-23 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 赵建民 |
| 英文摘要 | 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）作为近海生态系统的基础物种之一，同时也是重要的经济养殖物种。近年来，由于病原体侵袭和环境恶化，菲律宾蛤仔大规模死亡现象频繁发生，严重影响了近海生态系统的稳定性和养殖产业的可持续发展。鉴于贝类独特的开放循环系统，海水环境中的有害致病菌或污染物可直接与血淋巴细胞接触，从而对机体的细胞免疫产生负面影响。胞外陷阱（Extracellular traps，ETs）作为一种新兴的固有免疫防御手段，在抵御病原微生物入侵方面发挥了重要作用，已成为细胞免疫反应中不可或缺的一部分。然而，ETs的过度释放亦能触发免疫毒性，并造成负面影响。目前，关于海洋贝类ETs的研究多聚焦于现象表征与免疫功能评估，而ETs发生的潜在调控机制尚有待于深入探索。本研究旨在探究革兰氏阴性细菌细胞壁成分脂多糖（LPS）以及内分泌干扰物壬基酚（NP）对菲律宾蛤仔血淋巴细胞ETs发生的影响，并探讨其潜在的分子调控机制，以期能够为理解海洋贝类在应对环境污染和病原体侵袭时的免疫响应机制提供理论依据。取得的主要研究结果如下： 1. 组蛋白H2A参与细菌诱导的ETs抗菌免疫应答 从菲律宾蛤仔中克隆并表征了一种组蛋白H2A（命名为RpH2A），RpH2A开放阅读框（ORF）包含387 bp，为编码128个氨基酸的多肽，其预测的蛋白质结构域高度保守，仅包含一个H2A结构域；RpH2A的氨基酸序列与其他物种的H2A序列具有较高的同源性（57.1%-96.1%）。对菲律宾蛤仔进行鳗弧菌攻毒实验，发现RpH2A的mRNA表达量在刺激6小时和12小时后显著上调，分别达到对照组的8.08倍（p < 0.01）和8.50倍（p < 0.01）。体外原核表达了RpH2A重组蛋白（rRpH2A），并探究了其免疫活性，结果发现：rRpH2A蛋白对脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）表现出较强的亲和力，且其结合活性具有剂量依赖性。此外，rRpH2A对模式细菌大肠杆菌具有杀菌作用，其杀菌能力随着蛋白浓度的升高而增强。此外，大肠杆菌（1 MOI）能够诱导血淋巴细胞释放ETs，并伴有活性氧（ROS）爆发。共定位分析发现，具有抗菌活性的RpH2A分布于ETs结构周围。这些ETs能够显著抑制大肠杆菌的生长，其抑菌效应可能由位于ETs中的RpH2A介导。本研究表明，组蛋白RpH2A可作为抗菌肽，在菲律宾蛤仔血淋巴细胞ETs的抗菌免疫反应中发挥重要作用。 2. LPS通过TLR-Raf-MEK-ERK-ROS信号通路调控ETs的形成 选取革兰氏阴性细菌细胞壁主要成分脂多糖（LPS）作为体外刺激物，以探讨菲律宾蛤仔血淋巴细胞中细菌诱导胞外陷阱（ETs）形成的分子机制。结果发现：LPS（1 μg/L）能够以时间依赖的方式诱导血淋巴ETs的形成，其中DNA构成了基本骨架，而抗菌肽RpH2A则是重要的蛋白组分。LPS刺激后，血淋巴细胞中髓过氧化物酶（MPO）和ROS的生成显著增强，并以依赖于MPO和ROS的方式诱导血淋巴细胞ETs的形成。进一步分析发现，LPS刺激导致血淋巴细胞中磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）的丰度升高，Raf抑制剂和MEK抑制剂能够抑制LPS诱导的ERK磷酸化上调，表明LPS通过经典的三级激酶级联，即Raf-MEK-MAPK通路激活ERK信号。ERK抑制剂能够显著抑制LPS诱导的ROS爆发，并限制ETs的形成；阻断ROS的产生也能减缓LPS诱导的ERK磷酸化及ETs的形成，这表明ERK-ROS正反馈环参与了LPS诱导的ETs发生。此外，血淋巴细胞中Toll样受体（TLR）的mRNA表达水平在LPS刺激后显著上调，通过RNA干扰（RNAi）敲减TLR的表达能够抑制LPS诱导的ERK磷酸化和ETs形成，表明TLR可能参与了LPS的识别，并通过ERK调控ETs的发生。向菲律宾蛤仔体内注射LPS后，观察到血淋巴细胞中ROS生成增多、ERK蛋白磷酸化增强，以及鳃组织中出现纤维状的ETs样结构。LPS诱导产生的ETs能够捕获灿烂弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌，并表现出广谱的抑菌作用。综上，本研究初步解析了细菌诱导ETs形成的分子机制：血淋巴细胞通过膜受体TLR识别细菌LPS，启动胞内MAPK级联反应调控ROS产生，进而促进ETs的释放以抵御细菌的入侵。 3. NP通过MAPK/ERK信号促进ROS爆发和糖酵解调控ETs的形成 选取海水中常见的内分泌干扰物壬基酚（NP）作为刺激物，探究了其对血淋巴细胞ETs形成的影响，以解析NP对菲律宾蛤仔的免疫毒性作用机制。结果发现：NP（10 μg/L、50 μg/L和100 μg/L）以剂量依赖的方式显著降低血淋巴细胞的活力。正常情况下，血淋巴细胞呈圆形，胞内颗粒和伪足清晰可见，而NP（100 μg/L）诱导ETs激活的血淋巴细胞破裂，伪足不明显，并伴有纤维样结构的形成。NP诱导的ETs发生依赖于MPO和ROS。转录组学分析发现，NP暴露后血淋巴细胞中MAPK、PI3K-AKT以及丙酮酸代谢和糖酵解/葡萄糖生成等信号通路呈上调趋势，而mTOR信号通路则呈下调趋势。在NP诱导的ETs形成过程中，MAPK信号通路被激活，表现为ERK蛋白的磷酸化水平上调。抑制ERK可导致NP诱导的NADPH氧化酶（NOX）表达降低，这进一步抑制ROS的产生，最终限制了ETs的释放，这表明ERK-NOX-ROS信号轴在NP诱导的ETs形成中发挥了作用。此外，NP暴露增加了血淋巴细胞对葡萄糖的摄取，同时也增强了糖酵解限速酶（己糖激酶和丙酮酸激酶）的活性及葡萄糖转运蛋白（GLUT）的表达。使用糖酵解抑制剂能够显著阻碍NP诱导的ETs形成，表明糖酵解在ETs形成中具有关键作用。NP暴露能够上调PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平，而下调mTOR蛋白的磷酸化水平。抑制ERK能够逆转NP暴露后PI3K和mTOR的磷酸化状态。同时，NP暴露还上调了转录因子c-Myc和HIF-1α的mRNA表达，这表明MAPK/ERK可能通过PI3K/AKT通路和mTOR信号，调控这些转录因子介导糖酵解反应，为ETs的形成提供能量。本研究初步证实了NP通过ERK-NOX-ROS轴和糖酵解调控血淋巴细胞ETs的形成，从而对菲律宾蛤仔血淋巴细胞产生免疫毒性。 综上所述，本研究探索了不同类型刺激物作用下菲律宾蛤仔血淋巴细胞ETs的发生，初步揭示了ETs形成的分子调控机制，相关结果不仅有助于深化对海洋贝类免疫系统功能的认识，也为海洋贝类疾病的防治策略提供了新的理论基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 源URL | [http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/38083]  |
| 专题 | 中科院烟台海岸带研究所知识产出_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 吕晓静. MAPK/ERK 信号通路对菲律宾蛤仔血淋巴细胞胞外陷阱的形成及调控机制研究[D]. 中国科学院大学. 2024. |
入库方式： OAI收割
来源：烟台海岸带研究所
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