类胡萝卜素是一类具有重要经济价值的萜类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、消炎、减肥等多种生物功效，在食品、医药和化妆品等领域展现了广阔的应用前景。类胡萝卜素的生物合成过程受到环境因子及功能基因的调控。β-胡萝卜素和岩藻黄素是目前海洋微藻中关注度很高的天然类胡萝卜素，在市场中广受欢迎。岩藻黄素由β-胡萝卜素经修饰而合成，位于类胡萝卜素合成途径下游位置，是β-胡萝卜素合成的延伸，二者均以牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）作为类胡萝卜素合成的前体物质。杜氏盐藻（Dunaliella salina (Dunal) Teodoresco, 1905）与三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin, 1897）是生产这两种类胡萝卜素的主要藻种，杜氏盐藻通过GGPP合成β-胡萝卜素，而三角褐指藻则利用β-胡萝卜素进一步合成岩藻黄素。目前，产业上常通过培养条件优化以及对目标产物代谢通路的“开源”与“节流”来实现微藻目标产物产量的提升。然而，现有研究多集中于微藻生物量及油脂产量优化，关于海洋微藻类胡萝卜素生物合成的培养条件优化与调控基因功能研究尚未开展。

本研究以碳氮比等培养条件为切入点，围绕杜氏盐藻β-胡萝卜素及其异构体9-顺式-β-胡萝卜素生物合成过程进行优化，挖掘调控类胡萝卜素高效合成及构型转变的关键分子靶点，并结合模式微藻三角褐指藻的遗传转化与基因编辑技术，探索类胡萝卜素高效合成的分子调控机制。主要研究结果如下：

（1）杜氏盐藻β-胡萝卜素及其异构体9-顺式-β-胡萝卜素的积累与碳氮比密切相关。对杜氏盐藻进行六种不同碳氮比条件下培养，当碳氮比为1 % CO₂ : 0.5 mM NO₃^-（2_LC/MN组，中碳氮比）时，总β-胡萝卜素的生产力达到峰值；而在碳氮比为1 % CO₂ : 5 mM NO₃^-（0.2_LC/HN组，低碳氮比）条件下，9-顺式-β-胡萝卜素的生产力最高。结果表明，中低碳氮比条件更有利于杜氏盐藻β-胡萝卜素的积累，并有助于提升其中9-顺式-β-胡萝卜素的比例。进一步的抗氧化能力测定显示，在高碳氮比（3 %或1 % CO₂ : 0.05 mM NO₃^-）条件下，细胞处于氧化应激状态，表现出更高的抗氧化活性，这种状态不利于9-顺式-β-胡萝卜素的积累。相反，中低碳氮比条件有助于减轻杜氏盐藻的氧化应激，保证β-胡萝卜素和9-顺式-β-胡萝卜素的高效生产。转录组学分析表明，与杜氏盐藻含β-胡萝卜素脂滴合成相关的胡萝卜素油滴蛋白CGP基因、β-胡萝卜素异构酶D27基因和萜类骨架代谢通路上的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶DXR和GGPP合成酶GGPPS基因均在高碳氮比条件下显著上调，但低碳氮比条件下GGPPS基因的表达水平也相对较高。此外，虽然我们尝试对杜氏盐藻D. salinaHG-01的D27基因和GGPPS基因进行遗传转化，但未能成功获得转基因藻株，因此，亟需利用模式微藻进一步验证这两个基因对β-胡萝卜素构型及其积累的调控作用。以上结果显示中低碳氮比条件更有利于杜氏盐藻β-胡萝卜素的生产及产品质量的提高。

（2）低碳氮比-低光强“两步法”培养策略显著促进三角褐指藻岩藻黄素的合成。表观生理参数的测定结果显示，低碳氮比（1 %或0.04 % CO₂ : 300 mg L^-1 NaNO₃）显著促进了藻细胞的生长，并有助于岩藻黄素的积累，提高了总蛋白含量，而中性脂含量则相对较低。相反，较高的碳氮比（1 %或0.04 % CO₂ : 37.5 mg L^-1 NaNO₃）抑制了三角褐指藻的生长，并显著降低了岩藻黄素的生产效率，同时导致总蛋白含量下降，而中性脂含量有所增加。因此，低碳氮比更有利于三角褐指藻合成岩藻黄素。此外，在正常光条件下培养至一定生物量后，通过不同低光强诱导的 “两步法”培养发现，10 μmol photons m^-2 s^-1的光强最有利于三角褐指藻积累岩藻黄素。在此光强下，尽管三角褐指藻的生长速度略有下降，但岩藻黄素的积累量显著增加，岩藻黄素生产力提升了13.31 %；同时，叶绿素a、c含量也显著提高，光合活性较其他光强条件下更高，表明较低光强促使三角褐指藻细胞大量合成捕光色素，进而提高了岩藻黄素的生产力。综上，优化类胡萝卜素生物合成过程的研究表明，低碳氮比与低光强的诱导条件有利于提高岩藻黄素的生产力。

（3）GGPP合成酶基因GGPPS在类胡萝卜素合成途径中发挥着至关重要的调控作用。基于杜氏盐藻和三角褐指藻碳氮比培养条件优化研究结果，挖掘了类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶基因GGPPS。通过成功克隆三角褐指藻中的GGPPS基因，随后进行了基因的过表达和敲除实验，并结合低光强与中、高光强的优化组合进行培养，分析了GGPPS基因调控对转基因藻株与野生型类胡萝卜素合成及其生理参数的影响。结果显示，GGPPS基因敲除后则导致生长受到抑制、光合活性下降、叶绿素含量减少及岩藻黄素生产力降低，而GGPPS基因过表达则显著提高了不同光强下三角褐指藻的生物量积累、光合活性和岩藻黄素含量，特别是在10 μmol photons m^-2 s^-1的诱导光强下，岩藻黄素生产力分别提升了23.3 %、29.7 %和13.2 %。这些研究结果表明，GGPPS是类胡萝卜素合成途径的关键调控基因，进一步证明通过“开源”调控萜类骨架合成能够有效提升类胡萝卜素的生产力。

（4）为达到“节流”的目标，本研究尝试改造其他以GGPP 为底物的萜类合成途径，对分支途径中的Fnt与ChlP进行了敲除实验，但未能获得功能缺失的敲除藻株，表明这两个基因可能对三角褐指藻的生长至关重要，基因突变可能导致致死表型。然而，通过反义敲降Fnt与ChlP却提高了岩藻黄素的干重占比，但同时也抑制了三角褐指藻的生长，进而导致岩藻黄素生产力下降。由此可见，“节流”策略并未达到提高类胡萝卜素生产力的预期目标，这也表明在对三角褐指藻类胡萝卜素合成路径进行改造时，需要进一步深入理解各基因的作用和功能，以便更高效地通过合成生物学途径提升目标产物的生产力。

综上所述，本研究表明，碳氮比等培养条件的优化以及GGPP合成途径的调控是提高海洋微藻类胡萝卜素生物合成效率的有效策略。

第1章 绪论

1.1 生产类胡萝卜素的经济微藻

1.1.1 生产β-胡萝卜素的微藻——杜氏盐藻

1.1.2 生产岩藻黄素的微藻——三角褐指藻

1.2 微藻类胡萝卜素及其合成途径研究进展

1.2.1 杜氏盐藻β-胡萝卜素合成途径

1.2.2 三角褐指藻岩藻黄素合成途径

1.2.3 环境因子对类胡萝卜素生物合成的调控

1.3 类胡萝卜素合成的共同前体——GGPP

1.4 研究内容与技术路线

1.4.1 研究内容

1.4.2 技术路线

第2章 不同碳氮比培养条件对杜氏盐藻β-胡萝卜素生物合成的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 藻体初步培养

2.2.2 不同碳氮比培养条件培养杜氏盐藻

2.2.3 生长测定与细胞形态观察

2.2.4 RNA提取、基因库构建和测序与组装比对

2.2.5 加权共表达网络分析（WGCNA）

2.2.6 实时荧光定量PCR检测

2.2.7 细胞成分测定

2.2.8 抗氧化相关酶活测定

2.2.9 数据分析

2.3 结果

2.3.1 生长参数、总碳氮含量与pH值在不同碳氮比下的变化

2.3.2 转录组数据组装和功能注释

2.3.3 不同碳氮比诱导处理下的加权共表达网络分析(WGCNA)

2.3.4 碳氮比影响的表达模块的GO和KEGG富集分析

2.3.5 响应碳氮比变化的hub基因的鉴定

2.3.6 不同碳氮比下胞内含物的变化

2.3.7 不同碳氮比下杜氏盐藻抗氧化能力变化

2.4 讨论

2.4.1 不同碳氮比对杜氏盐藻生长和胞内含物的影响

2.4.2 碳氮比变化下盐藻细胞的基因变化的响应

2.4.3 9-顺式-β-胡萝卜素的积累需要适宜的碳氮比培养条件

第3章 不同碳氮比培养条件对三角褐指藻岩藻黄素生物合成的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 不同碳氮比下藻细胞培养条件及处理

3.2.2 不同光强诱导藻细胞培养条件及处理

3.2.3 光合参数测定

3.2.4 色素提取与测定

3.2.5 中性脂含量与蛋白含量测定

3.3 结果

3.3.1 不同碳氮比培养下三角褐指藻的生长情况

3.3.2 不同碳氮比培养下三角褐指藻的色素含量

3.3.3 不同碳氮比培养下三角褐指藻的中性脂含量

3.3.4 不同碳氮比培养下三角褐指藻的总蛋白含量

3.3.5 不同碳氮比培养下三角褐指藻类胡萝卜素代谢通路基因表达量变化

3.3.6 低光诱导下三角褐指藻的生长与光合参数的变化

3.3.7 低光下三角褐指藻的类胡萝卜素与色素积累

3.4 讨论

3.4.1 高碳氮比抑制了三角褐指藻的生长

3.4.2 高碳氮比不利于三角褐指藻的岩藻黄素积累

3.4.3 低光诱导提高了三角褐指藻色素积累与光合活性

第4章 优化培养条件下类胡萝卜素合成关键基因GGPPS的功能研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 GGPPS的克隆与分析

4.2.2 三角褐指藻GGPPS过表达藻株的构建

4.2.3 三角褐指藻GGPPS敲除藻株的构建

4.2.4 GGPPS敲除与过表达藻株诱导处理

4.2.5 GGPPS过表达与敲除藻株光合参数测定

4.2.6 GGPPS过表达与敲除藻株色素提取与测定

4.2.7 GGPPS过表达与敲除藻株实时荧光定量分析

4.3 结果

4.3.1 GGPPS的克隆与序列分析

4.3.2 GGPPS过表达与敲除藻株构建与筛选验证

4.3.3 GGPPS过表达与敲除藻株生长与光合参数的变化

4.3.4 GGPPS过表达与敲除藻株的类胡萝卜素与色素积累

4.3.5 GGPPS过表达与敲除藻株实时荧光定量分析

4.4 讨论

4.4.1 GGPPS过表达促进了光合作用与色素积累

4.4.2 GGPPS敲除抑制三角褐指藻生长和色素积累

第5章 萜类骨架代谢“节流”改造对岩藻黄素合成的影响

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 Fnt和ChlP敲除藻株的构建

5.2.2 Fnt和ChlP沉默藻株的构建与验证

5.2.3 生长测定

5.2.4 色素测定

5.3 结果

5.3.1 Fnt和ChlP敲除株与沉默藻株构建

5.3.2 Fnt和ChlP沉默藻株色素含量测定

5.4 讨论

5.4.1 “节流”可以提高三角褐指藻的岩藻黄素含量但不利于生产

5.4.2 Fnt与ChlP对三角褐指藻细胞生长发育是必要的

第6章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 后续研究工作与展望

参考文献

附录 本文中出现的略缩词表

致 谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果