摘  要

   几丁质（chitin）是一种重要的海洋多糖，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）通过β-（1，4）-糖苷键连接形成，是世界上含量仅次于纤维素的多糖，主要存在于甲壳动物外壳，昆虫的内骨骼，真菌，硅藻以及原生动物细胞壁中。在生物材料、医药行业、美容保健以及工农业中，具有重要的应用和经济价值。几丁质生物合成的最后也是最关键的一步由几丁质合成酶催化完成，几丁质合成酶属于糖基转移酶2家族，是膜整合的蛋白质，具有合成和跨膜转运几丁质两种功能。受限于膜蛋白的研究困难，几丁质合成与跨膜转运的分子机理及两者的偶联机制研究目前仍有较大空白。

   本论文选取几丁质合成酶为研究对象，对其进行了一系列研究。研究内容主要包括三部分：第一部分筛选了几丁质合成酶基因，将其利用大肠杆菌和毕赤酵母进行了表达，对其中具有活性的几丁质合成酶进一步进行了纯化，并对表达纯化条件进行了优化；第二部分对病毒来源的几丁质合成酶CVK2的合成与跨膜转运功能，底物选择性以及反应动力学参数进行了研究，并利用纳米抗体辅助获得了其冷冻电镜结构；第三部分对大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的跨膜转运功能进行了研究。取得的主要研究结果如下：

1. 克隆了来源于细菌、古菌、真菌、病毒来源的8个几丁质合成酶基因，并对其表达菌株进行了筛选。确定了病毒来源的几丁质合成酶CVK2与Cvik1，马克思克鲁维酵母来源的几丁质合成酶Km1和Km2能够成功表达并定位于细胞膜，且具有几丁质合成活性。通过去垢剂筛选，确定了病毒来源的几丁质合成酶CVK2纯化所需的增溶去垢剂和纯化去垢剂分别为LMNG+CHS和GDN，并优化了纯化条件。
2. 验证了纯化后的病毒来源的几丁质合成酶CVK2在去垢剂环境中具有几丁质合成活性，并对酶反应条件进行了优化，确定了其最适阳离子为Mn²⁺，最适反应温度为30 ℃，最适反应pH为6.5。同时发现GlcNAc的加入对病毒来源的几丁质合成酶CVK2的活性没有影响。使用乳酸脱氢酶/丙酮酸激酶偶联法测定病毒来源的几丁质合成酶CVK2的最大反应速率V_max为0.01438±0.00201 mM/min，K_m=0.38884±0.21437 mM，k_cat=3.595±0.5025 min^-1。使用麦胚凝集素法测定病毒来源的几丁质合成酶的最大反应速率V_max为0.45563±0.11974 mM/min，K_m=1.62108±0.58733 mM，k_cat=113.9075±29.935 min^-1。测定了UDP与polyoxin B在对该酶的抑制常数分别为0.371 mM和0.189 mM。同时对其底物选择性进行了研究，确定了病毒来源的几丁质合成酶CVK2不能利用UDP-GlcA与UDP-Glc合成透明质酸和纤维素，但可能具有利用UDP-GlcN合成壳聚糖的能力。通过质谱鉴定了病毒来源的几丁质合成酶CVK2的产物聚合度为3-6。利用单颗粒冷冻电镜技术在纳米抗体的辅助下解析了病毒来源的几丁质合成酶CVK2在未结合底物状态下的蛋白结构，分辨率为3.76 Å，该酶行使功能时为单体状态，不同于已报道的二聚体形式的真菌来源几丁质合成酶。
3. 通过将大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS组装至蛋白脂质体，证明了该酶具有产物跨膜转运的功能，并通过对跨膜通道中的保守氨基酸位点进行突变验证了几丁质催化合成与跨膜转运功能的偶联性。

 

目  录

第1章 绪论... 1

1.1 几丁质及脱乙酰产物壳聚糖... 1

1.1.1 几丁质... 1

1.1.2 壳聚糖... 2

1.1.3 几丁质及壳聚糖的制备方法... 3

1.2 膜整合型糖基转移酶... 4

1.2.1 糖基转移酶... 4

1.2.2 多糖合成酶... 5

1.2.3 膜蛋白的表达纯化... 8

1.2.4 几丁质合成酶的研究进展... 15

1.3 单域抗体在膜蛋白结构中的应用... 19

1.4 本论文的研究意义与研究目的... 20

第2章 几丁质合成酶的筛选与表达纯化... 23

2.1 材料与方法... 23

2.1.1 实验仪器... 23

2.1.2 实验材料... 24

2.1.3 实验方法... 28

2.2 实验结果... 41

2.2.1 几丁质合成酶的基因筛选... 41

2.2.2 几丁质合成酶表达载体构建... 42

2.2.3 几丁质合成酶的表达菌株筛选... 43

2.2.4 几丁质合成酶的表达位置鉴定... 48

2.2.5 几丁质合成酶的原位活性检测... 49

2.2.6 几丁质合成酶的增溶去垢剂筛选... 51

2.2.7 几丁质合成酶的纯化去垢剂筛选... 55

2.2.8 几丁质合成酶的纯化条件优化... 64

2.3 分析与讨论... 69

第3章 病毒来源的几丁质合成酶的功能与结构研究... 73

3.1 材料与方法... 73

3.1.1 实验仪器... 73

3.1.2 实验材料... 73

3.1.3 实验方法... 74

3.2 实验结果... 84

3.2.1 病毒来源的几丁质合成酶CVK2稳定性验证... 84

3.2.2 几丁质合成酶合成活性检测... 85

3.2.3 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的产物鉴定... 91

3.2.4 抑制剂对病毒来源的几丁质合成酶CVK2的抑制效果研究... 92

3.2.5 GlcNAc对病毒来源的几丁质合成酶CVK2的影响... 93

3.2.6 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的动力学参数测定... 93

3.2.7 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的底物选择性... 95

3.2.8 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的产物跨膜活性检测... 101

3.2.9 病毒来源的几丁质合成酶CVK2产物合成方向鉴定... 105

3.2.10 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的产物扫描电镜表征... 107

3.2.11 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的产物聚合度鉴定... 108

3.2.12 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的聚集状态研究... 109

3.2.13 病毒来源的几丁质合成酶CVK2的结构研究... 113

3.2.14 单域抗体制备与辅助筛选... 118

3.2.15 纳米抗体辅助病毒来源的几丁质合成酶CVK2的结构研究... 121

3.3 分析与讨论... 127

第4章 真菌来源的几丁质合成酶的功能与结构研究... 133

4.1 材料与方法... 133

4.1.1 实验仪器... 133

4.1.2 实验材料... 133

4.1.3 实验方法... 133

4.2 实验结果... 135

4.2.1 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的合成活性检测... 135

4.2.2 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的产物表征... 135

4.2.3 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的底物选择性... 137

4.2.4 GlcNAc对大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的影响... 138

4.2.5 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS的processive性能检测... 138

4.2.6 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS产物跨膜转运活性检测... 141

4.2.7 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS冷冻电镜数据收集与处理... 142

4.2.8 大豆疫霉来源的几丁质合成酶PsCHS几丁质催化合成与跨膜转运功能偶联性研究... 148

4.3 分析与讨论... 150

全文总结与展望... 153

参考文献... 157

致  谢... 171

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 173