线虫是地球上数量最多的后生动物，海洋线虫是海洋底栖生态系统中数量最丰富的动物类群之一，生境细菌可为诸多自由生海洋线虫提供饮食营养。然而，生境细菌如何调控海洋线虫重要生命过程如生长发育、繁殖和寿命的机制尚不清楚。本研究使用遗传背景清晰的以细菌为食的海洋线虫Litoditis marina自交纯系为研究材料，深入探究了生境细菌调控宿主线虫生长发育和寿命的机理及肠道菌群特征。鉴于海洋细菌和海洋线虫均是海洋底栖生态系统中的优势类群，本研究拟为生境菌群如何调控海洋线虫重要生命过程及其与陆生近缘种秀丽线虫之间的进化发育比较研究提供新认知，通过构建新的海洋细菌‒线虫实验研究框架，将为深入研究在全球气候变化背景下细菌介导的宿主动物健康、生态系统保护和管理提供重要的科学参考。主要研究结果如下：

一、对海洋线虫L. marina的栖息地——汇泉湾潮间带环境中的细菌群落进行了全长16S rRNA基因扩增子测序，获得了5783个OTUs，在门水平上以变形菌门（Proteobacteria）（46.33%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（22.03%）、蓝细菌门（Cyanobacteria）（11.11%）和放线菌门（Actinobacteria）（6.30%）为主；在属水平上，伍斯菌属（Woeseia）（11.8%）为优势菌群。同时，分离培养了539株L. marina生境细菌，以弧菌属（Vibrio）、发光杆菌属（Photobacterium）、交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）、奥利亚菌属（Olleya）、芽孢杆菌属（Bacillus）和极地杆菌属（Polaribacter）为主。本研究分离培养的539株L. marina生境细菌中，含新物种28个，分别属于弧菌属、芽孢杆菌属、马里巴克特属（Maribacter）、光杆菌属（Photobacterium）、哈斯利菌属（Hasllibacter）和奇异弧菌属（Thaumasiovibrio）等。

二、探究了本研究分离的448种可培养菌株对海洋线虫L. marina生长发育的影响，发现52.23%的生境细菌能够支持L. marina的生长，剩余的47.76%则延迟L. marina发育或致死。根据海洋线虫在食用每种细菌时的生长速率，将生境细菌分为“有益”、”中等影响“和”有害“三种类型。进一步聚焦73种生境细菌代表性菌株（HQbiome），验证了单个生境细菌调控线虫生长发育的表型特征，并对其中72株本研究分离细菌进行了全基因组测序与组装。基于HQbiome全基因组序列信息，进行了代谢模型重建，结合随机森林模型发现生境细菌辅酶Q、血红素b、乙酰辅酶A、乙醛、丙酮酸盐和油酸盐等代谢通路与L. marina的生长发育呈显著正相关，而铁载体、维生素B6和萜烯代谢通路与L. marina的生长发育呈显著负相关。进一步的单一代谢物添加实验表明，辅酶Q、血红素b、乙酰辅酶A、乙醛和丙酮酸盐促进L. marina在Metabacillus halosaccharovorans、Alkalihalobacillus algicola和Paenisporosarcina quisquiliarum中的生长发育，而维生素B6的添加显著抑制L. marina在Shewanella algae中的发育。此外，本研究发现二甲磺酰丙酸降解I通路与L. marina的寿命呈正相关，而甘油降解I通路与L. marina寿命呈负相关。进一步的单一代谢物添加实验表明，在S. algae中添加1%甘油显著延长L. marina的寿命。

三、探究了海洋线虫L. marina 在HQbiome（73种菌）、HQbiome-1（29种有益菌株）和HQbiome-3（29种有益菌株和S. algae）生长时的肠道菌群定植特征，及HQbiome、HQbiome-1、有害菌株群落（HQbiome-2）和HQbiome-3对L. marina生长发育和寿命的影响。发现L. marina的肠道菌群在线虫生长约160小时后达到稳定状态，且肠道菌群定植没有选择性。食用HQbiome和HQbiome-3时，L. marina肠道菌群以S. algae为主，而食用HQbiome-1时以Vibrio parahaemolyticus为主，表明S. algae具有超强的菌群竞争和肠道定植能力。本研究发现，相较于HQbiome和HQbiome-2，有益菌组合HQbiome-1显著促进L. marina的生长发育，而HQbiome对L. marina发育的促进作用明显优于有害菌群HQbiome-2；喂食HQbiome-3时，L. marina的生长速度与HQbiome-1和HQbiome无显著差异。进一步发现，相比于HQbiome-1和HQbiome-2，HQbiome显著延长L. marina的寿命，而HQbiome-1和HQbiome-2对宿主寿命的影响相似；喂食HQbiome-3时，L. marina的寿命相比于HQbiome和HQbiome-1显著下降，而与HQbiome-2无显著差异。本研究发现宿主肠道菌群中的主导菌（即HQbiome中的S. algae和HQbiome-1中的V. parahaemolyticus）对宿主的生长发育而非寿命起主导作用。

四、发现448种海洋生境细菌喂食秀丽线虫Caenorhabditis elegans时，约80%的菌株能够支持C. elegans的生长，仅有20%的细菌延迟宿主发育或致死。随机森林模型偶联分析发现，海洋生境细菌GDP-甘露糖、UDP-α-D-半乳糖醛酸酯、β-丙氨酸、血红素b、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸、鸟嘌呤核苷酸、四氢蝶啶醇、辛酰、鸟嘌呤核苷酸、八链异戊二烯二聚醇酸酯和肉豆蔻酸等代谢通路与C. elegans的生长发育呈显著正相关，而UDP-N-乙酰-D-半乳糖醛酸酯、N-乙酰葡糖胺、poly-cis阿拉伯糖、甘露糖醇和四烯醇二磷酸酯等代谢通路与C. elegans的生长发育呈显著负相关。同时，本研究发现腺嘌呤营救（adenine salvage）通路产生的AMP和IMP与C. elegans的寿命呈显著负相关。此外，本研究探究了C. elegans在HQbiome（73种菌）和HQbiome-1（29种有益菌株）中生长时的肠道菌群定植特征，发现C. elegans的肠道菌群在线虫第1阶段幼虫（L1）孵育约160小时达到稳定状态，HQbiome喂养C. elegans时，肠道菌群以希瓦氏菌属为主导，而HQbiome-1喂养导致肠道菌群以假单胞菌属（Pseudomonas）为主，C. elegans的肠道菌群定植具有选择性。进一步发现相较于HQbiome和HQbiome-2，有益菌组合HQbiome-1显著缩短了C. elegans的产卵时间，而相较于HQbiome，有害菌群HQbiome-2显著延迟了C. elegans的产卵时间。有趣的是，相较于HQbiome和HQbiome-1，有害菌群HQbiome-2显著延长C. elegans寿命，而喂食HQbiome和HQbiome-1对C. elegans寿命影响相似。

五、海洋生境菌株对L. marina和C. elegans生长发育的影响呈显著正相关，仅有少数门的菌株相关性较差。通过随机森林模型关联分析发现，仅有4条代谢通路（GDP-甘露糖生物合成、有氧呼吸III、血红素b生物合成通路I和L-半胱氨酸降解通路III）与两种线虫（C. elegans和L. marina）的生长发育均显著相关，而生长发育调控相关的代谢通路在海陆线虫间大多不同。通过对L. marina和C. elegans肠道菌群的比较研究发现，海洋线虫对肠道细菌群落没有选择性，而C. elegans则表现为明显的选择性。HQbiome、HQbiome-1和HQbiome-2三种细菌混合菌群对C. elegans产卵时间与其对L. marina生长速率的影响趋势相似，即有益菌组合HQbiome-1促进两种线虫的发育速率；三种细菌群落对两种线虫寿命的影响存在较大差别，即有害菌组合HQbiome-2显著延长C. elegans寿命，而HQbiome显著延长L. marina寿命。

目 录

 

第1章 绪论................................................................................. 1

1.1 海洋无脊椎动物细菌群落的研究进展............................................................. 1

1.2 模式动物细菌群落的研究进展......................................................................... 3

1.3 秀丽线虫细菌及其与宿主互作的研究进展..................................................... 4

1.4 本研究的目的和意义......................................................................................... 6

1.5 技术路线............................................................................................................. 7

第2章 海洋线虫L. marina的生境细菌群落特征分析..................... 8

2.1 研究背景............................................................................................................. 8

2.2 材料和方法......................................................................................................... 8

2.2.1 全长16S rRNA基因测序及分析................................................................ 8

2.2.2 菌株的分离培养和保存............................................................................ 10

2.2.3 实验试剂.................................................................................................... 11

2.2.4 实验仪器.................................................................................................... 12

2.3 结果................................................................................................................... 13

2.3.1 海洋线虫生境细菌群落组成特征............................................................ 13

2.3.2 海洋线虫生境细菌群落α多样性分析.................................................... 15

2.3.3 海洋线虫生境细菌的大规模分离培养.................................................... 18

2.4 讨论................................................................................................................... 21

2.5 本章小结........................................................................................................... 22

第3章 生境细菌调控海洋线虫L. marina生长发育和寿命的机制. 23

3.1 研究背景........................................................................................................... 23

3.2 材料和方法....................................................................................................... 23

3.2.1 L. marina的培养........................................................................................ 23

3.2.2 L. marina的生长发育实验........................................................................ 23

3.2.3 L. marina的寿命实验................................................................................ 25

3.2.4 HQbiome代表菌落的构建........................................................................ 25

3.2.5 HQbiome菌株的全基因组测序................................................................ 26

3.2.6 进化树构建................................................................................................ 29

3.2.7 系统发育信号分析.................................................................................... 29

3.2.8 代谢模型重建............................................................................................ 29

3.2.9 BIOLOG验证实验.................................................................................... 32

3.2.10 碳源利用能力数据验证.......................................................................... 32

3.2.11 发酵产物模拟.......................................................................................... 33

3.2.12 代谢通路与系统发育相关性.................................................................. 33

3.2.13 HQbiome菌株间功能和表型多样性的分析.......................................... 33

3.2.14 适应策略分析.......................................................................................... 33

3.2.15 代谢通路富集分析.................................................................................. 34

3.2.16 生物合成基因簇（BGCs）预测............................................................. 34

3.2.17 回归模型.................................................................................................. 34

3.2.18 单一代谢物添加实验.............................................................................. 34

3.2.19 实验试剂.................................................................................................. 35

3.2.20 实验仪器.................................................................................................. 35

3.3 结果................................................................................................................... 36

3.3.1 生境细菌对海洋线虫L. marina生长发育的影响................................... 36

3.3.2 HQbiome细菌调控海洋线虫生长发育.................................................... 40

3.3.3 HQbiome菌株对L. marina寿命的影响.................................................. 42

3.3.4 HQbiome菌株基因组测序........................................................................ 44

3.3.5 基于HQbiome菌株全基因组的代谢模型重建....................................... 49

3.3.6 HQbiome菌株的代谢功能分析................................................................ 54

3.3.7 HQbiome菌株的代谢多样性分析............................................................ 56

3.3.8 HQbiome菌株生长模拟............................................................................ 57

3.3.9 HQbiome菌株的代谢通路富集分析........................................................ 58

3.3.10 弧菌属和希瓦氏菌属菌株的代谢通路富集分析.................................. 60

3.3.11 L. marina生长发育和寿命与细菌代谢通路的随机森林分析.............. 60

3.3.12 添加实验验证候选关键代谢物如何调控海洋线虫发育与寿命.......... 63

3.3.13 HQbiome菌株的生物合成基因簇（BGCs）挖掘................................ 65

3.4 讨论................................................................................................................... 67

3.5 本章小结........................................................................................................... 69

第4章 海洋线虫L. marina肠道菌群特征分析及其对宿主发育与寿命的潜在影响 71

4.1 研究背景........................................................................................................... 71

4.2 材料和方法....................................................................................................... 71

4.2.1 线虫的培养................................................................................................ 71

4.2.2 HQbiome、HQbiome-1、HQbiome-2和HQbiome-3混合菌液制备..... 72

4.2.3 肠道菌群样本收集.................................................................................... 74

4.2.4 肠道细菌测序............................................................................................ 74

4.2.5 线虫的生长发育实验................................................................................ 74

4.2.6 线虫的寿命实验........................................................................................ 74

4.2.7 实验试剂.................................................................................................... 75

4.2.8 实验仪器.................................................................................................... 75

4.3 结果................................................................................................................... 75

4.3.1 L. marina的肠道菌群特征........................................................................ 75

4.3.2 L. marina肠道菌群对其生长发育及寿命的潜在影响............................ 78

4.4 讨论................................................................................................................... 80

4.5 本章小结........................................................................................................... 81

第5章 生境细菌调控海洋线虫与秀丽线虫生长发育、寿命与肠道菌群特征的比较分析 82

5.1 研究背景........................................................................................................... 82

5.2 材料和方法....................................................................................................... 82

5.2.1 C. elegans的培养....................................................................................... 82

5.2.2 C. elegans的产卵实验............................................................................... 82

5.2.3 C. elegans的寿命实验............................................................................... 83

5.2.4 C. elegans的肠道菌群实验....................................................................... 83

5.2.5 实验试剂.................................................................................................... 83

5.2.6 实验仪器.................................................................................................... 83

5.3 结果................................................................................................................... 83

5.3.1 L. marina生境细菌对C. elegans生长发育的影响................................. 83

5.3.2 海洋生境细菌对L. marina和C. elegans生长发育影响的相关性........ 85

5.3.3 HQbiome菌株对C. elegans生长发育的影响及代谢相关性................. 87

5.3.4 L. marina生境细菌对C. elegans寿命的影响及代谢相关性................. 88

5.3.5 C. elegans的肠道菌群特征....................................................................... 90

5.3.6 C. elegans肠道菌群对其生长发育和寿命的潜在影响........................... 91

5.3.7 C. elegans与L. marina的肠道菌群及环境菌群的α多样性比较分析. 92

5.3.8 L. marina与C. elegans对肠道菌群选择性的比较................................. 93

5.4 讨论................................................................................................................... 94

5.5 本章小结........................................................................................................... 96

第6章 结论与展望..................................................................... 97

6.1 主要结论........................................................................................................... 97

6.2 创新点............................................................................................................... 99

6.3 研究展望........................................................................................................... 99

参考文献.................................................................................... 100

致 谢......................................................................................... 117

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果................. 118