条斑紫菜（Pyropia yezoensis）是一种重要的大型经济海藻，隶属于红藻门（Rhodophyta）红毛菜纲（Bangiophyceae）。红藻在真核生物进化的过程中处于关键节点地位，所以条斑紫菜不仅仅是经济物种，也是研究大型海藻基础生物学的模式生物。无论是作为经济物种还是模式生物，高效的基因操控技术，包括稳定高效的遗传转化、转基因表达和精准基因编辑，都尤为重要。作为重要的经济海藻，条斑紫菜的良种培育长期依赖传统的诱变和选择育种方式，周期长且效率低，良种数量少，造成当前产业上对良种的需求与种质资源匮乏之间存在严重的供需矛盾。因此，亟需创新育种技术，突破底层技术瓶颈，构建精准、可控和高效的分子育种技术体系。条斑紫菜的全基因组序列已成功解析，为从分子层面揭示真核光合生物的进化与适应机制奠定了重要基础。然而，条斑紫菜遗传转化体系建立较晚，单一的遗传转化手段和筛选标记不利于开展深入的分子功能研究。条斑紫菜基因表达调控方式独特，转基因的表达常受到抑制，导致功能基因难以发挥作用。此外，反向遗传学研究关键技术始终没有在条斑紫菜中建立，导致在基因功能的解析和优良性状的挖掘方面进展缓慢。

针对条斑紫菜存在的上述问题，本文首先对新型遗传转化体系进行了探索；其次，根据生活史特征和遗传特点，针对性地构建了基于CRISPR/Cas系统的条斑紫菜基因编辑功能模块，成功实现了条斑紫菜靶向基因的精准编辑；最后，通过RNA干扰的方式抑制组蛋白去乙酰化复合体亚基SAP30基因的表达，显著提高了条斑紫菜的稳定遗传转化效率和外源基因的稳定表达。本文的主要研究结果如下：

（1）优化了条斑紫菜基因枪转化的合适条件，探索了新型遗传转化体系。首先，比较了3种不同的质粒浓度和2种不同的微弹介质（金粉颗粒和钨粉颗粒）对转化效率的影响，结果表明500 ng/μL的质粒浓度和0.6 μm金粉介质能达到比较理想的轰击效果。其次，构建了条斑紫菜功能基因的干扰及过表达载体，对基因枪转化及潮霉素筛选的体系进行了评估，发现总体阳性率不超过41.7%，表明仍存在很大的提升空间。此外，初步探索了条斑紫菜细菌接合转化方法，该方法可以避免基因枪转化过程中外源基因在宿主染色体上随机整合可能带来的潜在风险。接合转化是一种无痕转化法，通常用于无DNA残留的基因编辑系统。本研究已构建适用于条斑紫菜的细菌接合转化载体系统，后续研究仍在进一步优化之中。最后，为了补充条斑紫菜的抗性标记库，本研究对氯霉素、卡那霉素、草铵膦和嘌呤霉素进行了试验。发现条斑紫菜对100 mg/L氯霉素，800 mg/L卡那霉素和50 mg/L嘌呤霉素敏感，可作为候选的筛选标记使用。

（2）系统地构建了基于CRISPR/Cas系统的条斑紫菜精准基因编辑模块，成功实现了功能基因靶向编辑。CRISPR系统核心元件是Cas核酸酶和gRNA。本研究首先根据条斑紫菜密码子偏好性对SpCas9进行了序列优化，得到PyCas9；筛选了条斑紫菜内源的强启动子PypUbi1用于驱动PyCas9表达；验证了自断裂肽P2A在紫菜体内的功能，并用于富集表达PyCas9和潮霉素抗性基因Hyg，构建了PypUbi1::PyCas9-P2A-Hyg-NosT表达盒。gRNA的表达一般由聚合酶Ⅲ型（Pol Ⅲ）启动子驱动，本研究通过cRT-PCR技术鉴定了条斑紫菜内源的U6基因，据此克隆了U6启动子（PyU6 pro）并验证其功能，随后构建了PyU6 pro::gRNA-U6T表达盒。通过基因枪方法将包含PyCas9表达盒和gRNA表达盒的载体转化到条斑紫菜中，结果表明，强启动子PypUbi1驱动的富集表达盒筛选效率极高，验证的藻株中PyCas9均表达成功。条斑紫菜U6启动子可以驱动gRNA高效表达。

通过对73株条斑紫菜阳性株的靶基因进行Sanger测序，发现有35株发生了基因编辑，比例达到47.9%，表明基于CRISPR/Cas系统的靶向基因编辑成功。其中，基因编辑嵌合体28株，占比38.4%；纯合体有7株，比例为9.6%。突变的类型呈现多样化，包括单/多碱基替换、缺失和插入，也包括大片段的删除和插入，其中最大的片段是414 bp的插入。对150株阳性株混合样品提取DNA，以此为模板扩增靶基因，然后进行高通量测序和SNP检测。平均测序深度超过50,000×。结果检测到大量SNP，所有的SNP位点位于PAM位点下游15 bp至上游17 bp之间，表明切割的靶向效果精准。突变频率最高的区域是PAM上游的-1至-4位的四个碱基，这与已知的CRISPR/Cas9基因编辑的特点一致。

研究还 发现，在转基因藻株筛选过程中由单孢子发育而来的阳性株有高达80%（28/35）是嵌合体，纯合体则较少，仅占20%（7/35）。我们对嵌合体和纯合体的PyCas9和gRNA表达量进行了验证。RT-qPCR结果表明，所有株系中均表达了PyCas9和gRNA，但是纯合体中PyCas9和gRNA表达量远高于嵌合体。与内参基因PyAct1相比（100%），纯合体PyCas9表达量1195%，而嵌合体平均为9.7%，差异超过120倍；纯合体gRNA表达量为734%，嵌合体平均为0.8%，二者差异超过900倍。由此可见，纯合体中PyCas9和gRNA都是高表达，如此超高量表达促使单孢子阶段高效地产生RNP复合物，完成基因编辑并发育成纯合体植株。经过分析，我们认为这种基因表达的差异极有可能与表观修饰调控有关。通常情况下，条斑紫菜对外源转入的PyCas9和gRNA启动子区进行了表观修饰，导致其启动子活性降低，抑制其表达。此外，我们发现这种表观修饰抑制仅仅针对外源转入的基因，而基因组本身的启动子活性不受影响。虽然嵌合体中PyCas9和gRNA相对表达量仅有9.7%和0.8%，但这是与内参基因相比的结果，实际上，生物体内大多数功能基因的表达量都无法达到内参基因的9.7%。因此，虽然嵌合体中PyCas9和gRNA表达相对较低，但依旧以较低效率发挥基因编辑的功能。

（3）针对条斑紫菜外源基因表达效率低的问题，本论文设计了基于双核酶方式表达反义RNA，干扰表观遗传修饰关键基因表达，显著提高了外源基因表达效率，证明了条斑紫菜的表观修饰系统参与了对外源基因表达的调控。基于外源基因表达抑制的现象，以及表观修饰对基因调控的原理，我们认为条斑紫菜外源基因的沉默可能受到表观修饰作用。经过比对分析，我们选定了条斑紫菜12个与组蛋白去乙酰化过程有关的候选基因。构建了由锤头核酶（HH）和丁型肝炎病毒核酶（HDV）双核酶系统介导的分别针对这12个候选基因的反义RNA表达盒，同时使用GUS报告基因表征外源基因的表达水平。经过转化筛选，在T1代中发现去乙酰化酶协同抑制复合体亚基SAP30干扰株的GUS超表达。对T1代单个叶片进行GUS染色，RNAi_SAP30（RNAi组）组中不表达GUS的比例为8.3%（2/24），表达GUS的嵌合体比例为37.5%（9/24），全株表达GUS的纯合体占比54.2%（13/24），其中，强表达（染色溶液变蓝）藻株占比为54.2%株（13/24）；无RNAi的对照组（Mock组）中，不表达GUS的比例为18.2%（8/44），嵌合表达为72.7%（32/44），纯合体仅占9.1%（4/44），没有发现GUS强表达的藻株。分别挑选Mock组和RNAi组的单株扩大培养，RNAi组的株系进行半定量PCR验证了核酶切割效果，发现锤头核酶HH切割效果很好，表明反义RNA成功释放。对Mock组和RNAi组DNA水平上GUS基因拷贝数进行验证，发现RNAi组GUS基因拷贝数更低，表明RNAi组GUS表达量的升高与基因拷贝数无关。RT-qPCR结果表明，RNAi组SAP30表达量显著低于Mock组，且GUS表达量显著高于Mock组，说明抑制SAP30的表达能促进GUS表达，SAP30极有可能参与了条斑紫菜对外源基因表达的沉默。分别挑取30株T2代幼苗进行GUS染色，发现Mock组中仍有5株完全无GUS表达，大部分（60%）依旧是嵌合体或GUS表达很弱，仅有7株GUS高表达（染色溶液变蓝）；RNAi组中，30株T2代幼苗全部高表达，溶液变蓝，表明SAP30基因表达量降低可以持续使外源基因高表达。通过以上研究，我们认为组蛋白去乙酰化修饰是条斑紫菜抑制外源基因表达的重要调控手段，去乙酰化酶复合体亚基SAP30参与了这一调控过程。

综上，本论文优化了基因枪转化条斑紫菜的合适条件，试验了不同抗生素的敏感性，探索了细菌接合转化方法，为进一步开发新型遗传转化体系奠定了基础；实现了基于CRISPR/Cas系统的精准基因编辑，填补了条斑紫菜反向遗传学关键技术的空白；研究了条斑紫菜表观修饰对外源基因的表达调控，发现了潜在的调控基因。本文的成果对发展条斑紫菜作为大型海藻基础生物学模式物种、解析特定性状形成的分子机制、以及开发基于CRISPR/Cas系统的精准分子设计育种体系提供了重要的理论基础和技术支撑。