原多甲藻酸（azaspiracids，AZAs）是一类具有独特螺环结构的聚醚类海洋贝类毒素。AZAs在全球海域分布广泛，其毒性远超麻痹性及神经性贝类毒素，且常规烹饪和加工处理不能使其去除。快速准确地检测海水及水产品中的原多甲藻酸贝类毒素含量，对于海洋生态环境保护及水产品食品安全保障具有重要意义。目前AZAs的检测方法主要包括生物测定法、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）以及免疫分析法等。然而，这些方法存在依赖动物与细胞培养实验、需要借助大型精密仪器，以及试剂制备成本高、稳定性差等问题，难以广泛应用于对AZAs的现场快速分析。

本论文针对几种主要的AZAs贝类毒素开展核酸适配体的筛选工作，并以筛选获得的高亲和力核酸适配体为识别元件，采用杂交链式反应、滚环扩增等技术作为信号放大策略，发展了一系列电位传感新方法，实现了对海水及贝类样品中AZAs的简便、快速、高灵敏检测，为海洋生态环境保护与食品安全保障提供技术支撑。本论文具体研究内容如下：

1. 基于MRGO-SELEX技术筛选AZA1的核酸适配体

尽管常见贝类毒素的核酸适配体研究已广泛开展，但是原多甲藻酸毒素适配体的筛选迄今仍未见有文献报道。此外，常见的SELEX技术通常采用单一的正向筛选或反向筛选的模式，这些筛选过程往往存在筛选效率不高的问题。鉴于此，本章选择AZAs中毒性最强、最具代表性的AZA1毒素作为靶标分子，开发了基于多模式的筛选方法，实现了高特异性AZA1适配体的高效筛选。在筛选中，我们采用改进的基于磁性还原氧化石墨烯（magnetic reduced graphene oxide，MRGO）辅助分离的多模式SELEX技术（包括毒素先与核酸文库结合后加入MRGO的正向筛选模式Ⅰ，毒素先吸附到MRGO上后加入核酸文库的正向筛选模式Ⅱ，加入反筛靶标毒素排除低特异性核酸链的反向筛选模式Ⅲ），并通过调整ssDNA文库用量、靶标及反筛靶标的用量、孵育时间等条件逐步增加筛选压力，经过12轮正向筛选和3轮反向筛选，成功筛选获得了对AZA1具有高亲和力的核酸适配体，并进一步对初始筛选得到的核酸适配体序列进行了优化。所得核酸适配体的解离常数为29.8 ± 8.3 nM，该适配体展现出良好的亲和性和特异性，并在海水环境下表现出较好的稳定性，这将为后续构建用于海水样品或贝类等海产品中AZA1毒素的检测分析方法提供了新的识别元件。同时，改进的多模式MRGO-SELEX法通过各模式间的优势互补，显著提升了筛选过程的富集效率，提高了核酸适配体筛选的成功机率，为小分子靶标核酸适配体的高效筛选提供了新的方法学路径和可靠的技术方案。

2. 基于Capture-SELEX法筛选AZAs1-3的广谱核酸适配体

环境水体中往往同时存在多种原多甲藻酸类贝类毒素，因此实现水体中多种毒素同时识别和检测具有重要意义。鉴于此，在上一章研究的基础上，本章选择自然界中最常见的三种原多甲藻酸类贝类毒素AZA1、AZA2和AZA3作为研究对象，利用改进的多重捕获-SELEX（Capture-SELEX）技术，筛选可同时识别3种原多甲藻酸的广谱性核酸适配体。在筛选过程中，我们采用多模式筛选方法，即12轮以AZAs1-3为靶标的混合筛选、3轮以AZA2为靶标的单一靶标的筛选和3轮以AZA3为靶标的单一靶标的筛选，以及随后的高通量测序、序列分析、性能检测，获得了对AZAs1-3三种靶标具有相似亲和力的广谱核酸适配体。截短优化后的广谱核酸适配体对AZAs1-3三种贝类毒素的解离常数分别为37.3 ± 7.9、32.2 ± 5.1和44.1 ± 6.4 nM，这表明该适配体对3种原多甲藻酸均具有良好的亲和力。此外，所得适配体对其他常见贝类毒素（腹泻性贝类毒素、麻痹性贝类毒素、失忆性贝类毒素等）也展现出良好的选择性，这将为后续构建用于多种AZAs毒素同时检测的传感器技术奠定重要基础。此外，需要指出的是，我们研制的改进型多重捕获-SELEX技术简化了筛选流程，有效缩短了试验周期、节约了实验成本，将为筛选某一类靶标的广谱适配体提供了可借鉴的技术路径与方法学参考。

3. 基于线性杂交链式反应的核酸适配体电位传感法检测AZA1

目前针对AZAs贝类毒素的检测主要基于生物测定法、液相色谱-质谱联用法及免疫分析法。然而，迄今为止，尚未有基于核酸适配体的AZAs毒素传感检测方法的报道。本研究以上述筛选所得的AZA1核酸适配体为识别分子，结合线性杂交链式反应（hybridization chain reaction，HCR）为信号放大策略，构建了一种检测AZA1的核酸适配体电位传感新方法。在该传感方法中，核酸适配体作为引发链在磁珠表面启动HCR反应，形成具有DNA聚阴离子纳米结构的功能化磁珠；当AZA1存在时，其与核酸适配体的特异性结合作用会导致DNA纳米结构从磁珠表面解离；基于静电相互作用，以鱼精蛋白聚阳离子作为信号指示离子，利用薄膜聚阳离子敏感电极电位法检测磁珠表面DNA聚阴离子负载量的变化，实现对AZA1的定量分析。在最优实验条件下，该法对AZA1的检测线性范围为10 - 250 pM，检测限为8.5 pM；该法具有良好的选择性，5种常见的海洋生物毒素不干扰测定。所构建的传感方法应用于实际海水样品的检测，加标回收率介于94%至104%之间。

4. 基于非线性杂交链式反应的核酸适配体电位传感法检测AZA1

线性杂交链式反应在实际应用中存在反应动力学缓慢、信号放大效率有限，以及因DNA发夹结构的不稳定性引起的信号泄漏等问题。因此，为提升检测灵敏度并降低背景干扰，本章以基于两个双链DNA底物设计的非线性杂交链式反应作为信号放大策略，开发了一种用于AZA1贝类毒素检测的高灵敏核酸适配体电位传感方法。使用双链DNA底物而非发卡结构作为自组装单体可以避免发卡结构不稳定导致的信号泄漏问题，降低背景信号；NHCR反应指数级的放大效率进一步提高检测方法的灵敏度。该传感体系以筛选获得的AZA1核酸适配体作为识别元件，通过非线性杂交链式反应（nonlinear hybridization chain reaction，NHCR），在磁珠表面生成DNA聚阴离子纳米结构；AZA1的存在可以引起磁珠表面DNA纳米结构数量的变化，该变化可通过以鱼精蛋白作为指示离子的薄膜聚阳离子敏感电极实现定量电位检测，从而实现对AZA1的高灵敏电位检测。在优化条件下，电极对AZA1检测的线性范围为4 - 50 pM，检出限达2.9 pM。本法有效抑制了信号泄漏，降低了背景信号，提高了信噪比。所构建的传感系统应用于实际海水和贝类样品中AZA1的检测，加标回收率在97%至106%之间。

5. 基于滚环扩增技术的核酸适配体电位传感法检测AZAs1-3

相较于无酶介导的杂交链式反应，滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）在聚合酶的催化作用下具有更快的反应动力学速率和更高的DNA产物分子量，并可与其他信号放大策略协同作用，实现检测信号的级联放大，从而显著提升检测灵敏度。基于此，本章构建了一种基于RCA与Ag₂S量子点协同信号放大策略的核酸适配体电位传感方法，用于对三种最常见原多甲藻酸类贝类毒素（AZAs1-3）总量的高灵敏检测。本研究以上述筛选所获得的AZA1s-3广谱核酸适配体作为识别元件，其一端固定到磁珠表面，另一端连接RCA引发链；在环状模板和聚合酶的共同作用下，发生在磁珠表面的RCA反应催化生成DNA单链；将载有Ag₂S量子点的核酸链以碱基互补的方式固定到生成的DNA单链上，构建出高密度负载量子点的功能化磁珠。经酸化处理后，磁珠表面的Ag₂S释放出Ag⁺，可通过银离子选择性电极进行定量检测；当功能化磁珠与AZAs1-3作用后，由于核酸适配体与靶标结合，导致RCA反应生成的DNA长链解离，从而使得磁珠表面的Ag₂S数量减少，引起酸化释出的Ag⁺浓度下降。由于核酸适配体与靶标结合导致磁珠表面的Ag₂S数量减少，进而引起电极电位下降。通过测定功能化磁珠与不同浓度AZAs1-3作用前后的电极电位变化，可实现对AZAs1-3总量的高灵敏检测。本法对AZAs1-3的检测线性范围为0.5 - 20 pM，检出限低至0.28 pM，性能显著优于基于杂交链式反应的传感方法。该传感方法成功应用于海水及贝类样品中AZAs1-3总量的检测，验证了其良好的实用性与可靠性。