血卵涡鞭虫（Hematodinium spp.）是一类主要感染海水甲壳动物的寄生甲藻，其主要寄生在海水甲壳类动物的血淋巴以及肝胰腺、心脏、鳃等组织血腔中。随着感染进程的发展，该寄生甲藻对宿主生理功能造成严重损害，最终引发宿主死亡。流行病学调查显示，血卵涡鞭虫已在全球范围内寄生感染70余种海水甲壳动物，并在多种海水养殖或野生经济甲壳类中引发流行性病害，严重威胁海水甲壳类渔业生产的可持续健康发展。目前，血卵涡鞭虫的相关研究主要集中于其流行病学特征、物种鉴定、检测技术、生活史过程、传播途径和病原-宿主互作等方面，其中关于血卵涡鞭虫与其甲壳类动物宿主的互作机制，特别是免疫调控和物质代谢交流等方面仍缺乏系统研究。血卵涡鞭虫与顶复门（Apicomplexa）同属于囊泡虫总门（Alveolata），在进化上具有较近的亲缘关系。且两者具有相似的生物学特征，均需依赖宿主细胞完成生活史周期。近年来研究发现，多种顶复门类寄生虫均可通过外泌体microRNA调控宿主的免疫应答和物质代谢过程。
外泌体是一种在细胞间信息传递中发挥重要作用的细胞囊泡，其能够包裹并传递供体细胞的核酸（mRNA、miRNA、lncRNA等）、蛋白及脂质等物质至受体细胞，从而实现对受体细胞功能的调控。其中，外泌体miRNA因其能够特异性靶向调控受体细胞的基因表达，在宿主-病原互作过程中发挥着关键作用。然而，目前关于血卵涡鞭虫与宿主的互作机制研究主要从宿主角度展开，关于血卵涡鞭虫侵入宿主后如何调控宿主免疫应答和物质代谢过程，其在感染过程中是否通过外泌体miRNA调控宿主免疫及代谢过程亟待深入探究。
基于上述研究现状，本论文以血卵涡鞭虫（Hematodinium perezi）与其甲壳类宿主三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）为研究对象，系统解析血卵涡鞭虫外泌体miRNAs对甲壳类宿主免疫及物质代谢系统的调控机制。首先，利用不同感染程度的三疣梭子蟹，初步解析自然感染条件下血卵涡鞭虫在不同感染程度宿主体内的生活史阶段及组织分布特征；其次，以血卵涡鞭虫外泌体为切入点，对其进行分离鉴定及表征分析，测定外泌体miRNAs组成，并结合梭子蟹基因组进行宿主靶基因预测和免疫调控通路分析，然后进一步结合miRNA过表达和RNA干扰等下游实验验证分析血卵涡鞭虫外泌体miRNAs对宿主关键免疫通路的调控作用，解析外泌体miRNAs介导的血卵涡鞭虫免疫逃逸机制；此外，采用联合转录组学、代谢组学及靶向代谢流技术深入解析血卵涡鞭虫与宿主之间的物质代谢交流过程，明确血卵涡鞭依赖宿主进行寄生增殖过程的关键通路、物质及调控过程。以上研究工作进一步丰富了寄生甲藻血卵涡鞭虫与甲壳类动物宿主的互作机制研究。主要研究发现如下：
（1）自然感染条件下，随着宿主感染程度加剧，血卵涡鞭虫在宿主体内的生活史形态呈现明显阶段性变化。在轻度感染阶段，宿主血淋巴中血卵涡鞭虫主要表现为丝状滋养体（Filamentous trophonts），主要分布于宿主的胃的结缔组织和血淋巴中。当感染发展至中度时，血淋巴中血卵涡鞭虫主要为类变形虫状滋养体（Amoeboid trophonts），此时血卵涡鞭虫可能突破宿主的免疫屏障，在宿主表皮、肌肉、心脏及肝胰腺等多组织分布。在重度感染阶段，血淋巴中虫体进一步发展为孢子母细胞（Sporoblasts），其分布范围从最初的胃和血淋巴系统扩展至宿主多个重要组织，呈现出广泛的组织分布特征。
（2）血卵涡鞭虫具有分泌外泌体的能力，其外泌体呈现典型杯状囊泡结构，直径大小为80 – 150 nm。蛋白免疫印迹实验发现，外泌体标志蛋白CD9和热休克蛋白70（HSP70）在分离获得的外泌体中呈现高表达，而内质网标志蛋白CALNEXIN则几乎不表达，进一步证实了血卵涡鞭虫外泌体的成功分离。共孵育实验表明，血卵涡鞭虫外泌体能够向三疣梭子蟹血细胞迁移，侧面反映了其对宿主血细胞功能的潜在调控作用。此外，血卵涡鞭虫外泌体中含有血卵涡鞭虫来源的miRNA分子，这些miRNA可通过与宿主靶基因的特异性结合，调控宿主的免疫应答和代谢通路，如细胞凋亡、MAPK信号通路、内质网蛋白加工、Wnt信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、甘油磷脂代谢、N -聚糖生物合成等。
（3）在血卵涡鞭虫外泌体中鉴定发现2个新型miRNAs（PC-5p-81654-103和PC-5p-20520-538）和1个已知miRNA（bmo-mir-6497-p5-1SS4AG）参与调控其宿主三疣梭子蟹的免疫应答过程。功能研究表明，PC-5p-81654-103和PC-5p-20520-538能够分别特异性靶向抑制宿主myd88和tlr4基因表达，通过抑制其表达水平有效阻断了宿主TLR免疫信号通路，进而显著削弱宿主体液免疫应答。此外，bmo-mir-6497-p5-1SS4AG则能够通过靶向宿主的rictor基因干扰宿主血细胞中mTOR-RhoA信号通路的正常功能，抑制血细胞吞噬活性，进而削弱宿主对该寄生甲藻的细胞免疫防御过程。
（4）血卵涡鞭虫自身缺乏利用L-缬氨酸（L-Valine）和β-丙氨酸（β-Alanine）从头合成泛酸的代谢途径，其快速增殖期所需的泛酸主要依赖于宿主供应；然而代谢流分析结果进一步表明，宿主来源的泛酸能够被血卵涡鞭虫摄取用于合成下游乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和中长链脂肪酸等关键代谢产物；血卵涡鞭虫可通过外泌体miRNA PC-3p-84424_98调控宿主泛酸激酶基因（Pantothenate kinase，PANK）的表达，从而调节宿主泛酸代谢及辅酶A的生物合成；此外，我们在血卵涡鞭虫中鉴定到一个具有SSF结构域的泛酸转运候选蛋白（HPPAT），该基因全长1641bp，编码546个氨基酸，具有5个典型跨膜结构域，可能属于钠/溶质同向转运蛋白家族（Sodium: solute symporter family）。
本研究以寄生甲藻血卵涡鞭虫与三疣梭子蟹的互作体系为研究对象，初步分析了自然感染条件下血卵涡鞭虫在不同感染阶段宿主体内的生活史变化及其组织分布特征；首次对血卵涡鞭虫外泌体进行分离鉴定，并揭示了血卵涡鞭虫外泌体miRNAs介导的重要免疫逃逸机制；并初步解析了血卵涡鞭虫在寄生增殖过程中调控宿主物质代谢过程维持自身脂肪酸物质需求的分子机制。研究结果进一步丰富了寄生甲藻血卵涡鞭虫与甲壳动物宿主互作机制研究工作，加深了我们对寄生甲藻基础生物学特征的科学认知。

第1章 绪论... 1

1.1 血卵涡鞭虫的分类地位及其危害... 1

1.1.1 血卵涡鞭虫分类地位... 1

1.1.2 血卵涡鞭虫的遗传多样性... 1

1.1.3 血卵涡鞭虫的流行病学特征及其危害... 5

1.2 血卵涡鞭虫的生活史... 8

1.3 血卵涡鞭虫的传播途径... 12

1.4 血卵涡鞭虫与甲壳宿主的互作机制... 13

1.4.1 血卵涡鞭虫对宿主的免疫调控... 13

1.4.2 血卵涡鞭虫对宿主的代谢调控... 14

1.5 外泌体的生物学特征及其在寄生原虫-宿主互作中的作用... 15

1.5.1 外泌体的生物学特征... 15

1.5.2 寄生原虫外泌体microRNA调控宿主免疫响应和物质代谢作用... 17

1.6 本论文拟解决的关键科学问题... 19

1.7 本论文的研究目的、内容及意义... 19

1.7.1 研究目的与研究内容... 19

1.7.2 研究意义... 20

第2章 血卵涡鞭虫在宿主体内的增殖过程和组织分布特征... 23

2.1 前言... 23

2.2 实验材料与试剂... 24

2.2.1 主要实验仪器设备... 24

2.2.2 主要试剂... 25

2.3 实验方法... 25

2.3.1 养殖三疣梭子蟹样品采集... 25

2.3.2 三疣梭子蟹血淋巴中血卵涡鞭虫的形态学观察... 26

2.3.3 三疣梭子蟹血淋巴中血卵涡鞭虫计数... 26

2.3.4 组织病理样品制备及观察... 26

2.3.5 qRT-PCR检测三疣梭子蟹组织中的载虫量... 26

2.4 结果与分析... 29

2.4.1 自然感染三疣梭子蟹血淋巴中血卵涡鞭虫的生活史形态和丰度... 29

2.4.2 血卵涡鞭虫在不同感染程度三疣梭子蟹中的组织分布... 30

2.4.3 不同感染程度三疣梭子蟹组织中的载虫量... 36

2.5 讨论... 38

2.6 小结... 40

第3章 血卵涡鞭虫外泌体的分离鉴定及small RNA测序分析... 41

3.1 前言... 41

3.2 实验材料与试剂... 42

3.2.1 主要实验仪器设备... 42

3.2.2 主要试剂... 43

3.3 实验方法... 43

3.3.1 样品采集... 43

3.3.2 外泌体分离纯化... 44

3.3.3 血卵涡鞭虫外泌体鉴定... 45

3.3.4 血卵涡鞭虫外泌体迁移分析... 46

3.3.5 外泌体总RNA提取... 47

3.3.6 外泌体microRNA测序鉴定与生物信息学分析... 48

3.4 结果与分析... 49

3.4.1 血卵涡鞭虫外泌体特征... 49

3.4.2 三疣梭子蟹血细胞对血卵涡鞭虫外泌体的摄取... 49

3.4.3 血卵涡鞭虫外泌体的miRNAs测序分析结果... 50

3.4.4 寄生宿主前后血卵涡鞭虫外泌体miRNAs差异表达及其靶基因富集分析 53

3.4.5 不同感染程度宿主体内血卵涡鞭虫外泌体miRNAs差异表达及靶基因富集分析 55

3.5 讨论... 57

3.6 小结... 58

第4章 血卵涡鞭虫外泌体miRNAs调控三疣梭子蟹mTOR-RhoA和TLR信号通路 61

4.1 前言... 61

4.2 实验材料与试剂... 62

4.2.1 主要实验仪器设备... 62

4.2.2 主要试剂... 63

4.3 实验方法... 64

4.3.1 实验动物获取... 64

4.3.2 双荧光素酶报告实验... 64

4.3.3 miRNAs抑制和过表达... 66

4.3.4 三疣梭子蟹靶基因表达的RNA干扰... 66

4.3.5 实时定量荧光PCR.. 68

4.3.6 Western Blot实验... 70

4.3.7 三疣梭子蟹血细胞吞噬能力检测... 70

4.4 结果与分析... 71

4.4.1 血卵涡鞭虫显著上调的外泌体miRNAs的宿主靶基因验证... 71

4.4.2 血卵涡鞭虫外泌体miRNA对宿主靶基因的抑制作用... 74

4.4.3 宿主rictor基因沉默后对血细胞吞噬能力的影响... 76

4.4.4 宿主Myd88和tlr4基因分别沉默后对三疣梭子蟹TLR通路的影响... 77

4.5 讨论... 79

4.6 小结... 81

第5章 血卵涡鞭虫外泌体miRNAs调控三疣梭子蟹泛酸合成途径... 83

5.1 前言... 83

5.2 实验材料与试剂... 84

5.2.1 主要实验仪器设备... 84

5.2.2 主要试剂... 84

5.3 实验方法... 85

5.3.1 样品采集... 85

5.3.2 转录组测序与生物学分析... 85

5.3.3 非靶向代谢组学分析... 87

5.3.4 关键代谢产物（泛酸、乙酰辅酶A和ATP）的含量检测分析... 88

5.3.5 血卵涡鞭虫外泌体miRNAs对宿主物质代谢相关靶基因预测分析... 89

5.3.6 双荧光素酶报告实验... 90

5.3.7 血卵涡鞭虫滋养体获取泛酸途径分析... 90

5.3.8 血卵涡鞭虫泛酸转运相关候选基因（H. perezi Pantothenate Transporter，Hppat）全长cDNA序列克隆... 91

5.3.9 实时定量荧光PCR（qRT-PCR）检测... 94

5.3.10 血卵涡鞭虫摄取宿主泛酸后的靶向代谢流分析... 95

5.4 结果与分析... 95

5.4.1 组学解析不同感染程度宿主的肝胰腺中代谢通路和代谢产物差异... 95

5.4.2 组学解析不同感染程度宿主体内血卵涡鞭虫自身的代谢通路差异... 97

5.4.3 感染血卵涡鞭虫前后宿主体内血淋巴和肝胰腺中的泛酸含量变化... 99

5.4.4 体外培养条件下补充L-Val和β-Ala后血卵涡鞭虫胞内泛酸的含量变化 99

5.4.5 补充泛酸后血卵涡鞭虫胞内泛酸、乙酰辅酶A和ATP含量变化... 100

5.4.6 血卵涡鞭虫的同位素标记泛酸体外培养实验... 101

5.4.7 血卵涡鞭虫泛酸转运相关候选蛋白预测... 103

5.4.8 血卵涡鞭虫外泌体miRNA的宿主物质代谢相关靶基因预测及富集结果 106

5.5 讨论... 108

5.6 小结... 110

第6章 结论与展望... 111

6.1 结论... 111

6.2 创新点与展望... 112

参考文献... 113

附录一 海洋动物基因组DNA提取方法... 129

附录二 琼脂糖凝胶回收方法... 130

附录三 质粒提取方法... 131

附录四 3’RACE和5’RACE第一链cDNA合成方法... 132

附录五 血卵涡鞭虫泛酸转运候选基因HpPAT全长cDNA及其预测氨基酸序列 134

致 谢... 135

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 137