微藻能源（包括氢气和油脂等）因其可提高再生能源的产量、推动能源转型 并缓解环境问题而备受关注。我们前期研究发现，蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在氮限制条件下可以协同产生 H₂和油脂，但其规模生产仍受限于 高昂的生产成本和较低的能量转化率。本研究聚焦氮源和碳源对蛋白核小球藻光 合产氢协同油脂积累的影响，优化了氮限制策略及碳源选择，并对其产氢产油的 过程及调控机制进行了解析，旨在深化对蛋白核小球藻光合产氢协同油脂积累机 制的理解，并为推动微藻能源的工业化应用提供理论依据。主要研究结果如下：

（1） 采用氮限制“两步法”诱导蛋白核小球藻光合产氢协同油脂积累，发现 最佳氮限制策略为：在氮浓度为5%（0.35 mM NH₄Cl）的TAP培养基中预培养 蛋白核小球藻积累生物量，然后转移至相同氮浓度的新鲜 TAP 培养基中，密封 高光诱导藻细胞产氢产油。在该条件下，蛋白核小球藻的产氢量为241.42 mL L ^-1，总脂占细胞干重的45.0%。实验发现，氮限制条件下小球藻的光合放氧活性被 抑制，有利于体系厌氧条件的建立和氢酶的激活；同时光合电子传递效率下降， 氢酶被激活后作为光合电子传递的末端电子受体，消耗过剩的电子产生 H₂。此 外，氮限制条件下PSⅡ受体侧被过度还原，导致NADPH积累，为脂肪酸合成提 供还原力，促进油脂的积累。

（2） 通过对四种碳源的比较分析发现，2 mL L^-1的乙酸对蛋白核小球藻生 长的促进效果最显著，且在该浓度下，蛋白核小球藻的H₂产量、单位细胞总脂 含量及脂肪酸不饱和度显著升高。实验表明，添加乙酸可以抑制藻细胞的光合作 用活性，提高其呼吸速率，增强细胞耗氧能力，有利于建立厌氧环境，诱导氢酶 的激活。乙酸进入细胞后转变为乙酰-CoA，随后进入TCA循环产生NADH，为 电子传递链提供电子，从而促进H2的产生；此外乙酰-CoA和NADH也能为脂 肪酸合成提供底物和还原力，促进油脂的积累。

（3） 转录组分析结果显示，添加乙酸后，蛋白核小球藻产氢产油过程中糖 酵解、TCA循环、脂肪酸合成及呼吸途径相关基因均上调表达，说明乙酸通过增 强这些代谢途径提高小球藻H₂和油脂产量。产氢过程中抑制小球藻糖酵解、TCA 循环、AOX呼吸及光呼吸途径后，其产氢量分别下降约12%、95%、30%和9%， 这一结果与转录组数据一致。抑制TCA循环后小球藻的总脂含量提高了约19%， 可能是TCA循环被抑制后乙酰-CoA积累，脂肪酸合成底物增加，从而提高了小 球藻总脂含量。光呼吸被抑制后小球藻总脂含量降低了约9%，可能是光呼吸被 抑制后细胞中碳通量减少，脂肪酸合成前体乙酰-CoA减少，导致总脂含量降低。

第1章 绪论... 1

1.1 微藻产氢及产油的意义... 1

1.2 微藻产氢的研究进展... 1

1.2.1 产氢微藻的种类... 3

1.2.2 微藻产氢的基本原理... 3

1.2.3 提高微藻产氢量的方法... 4

1.3 微藻产油研究进展... 5

1.3.1 产油微藻的种类... 5

1.3.2 微藻油脂合成的基本原理... 6

1.3.3 提高产油量的方法... 7

1.4 微藻生产生物能源面临的主要挑战... 8

1.4.1 微藻产氢的主要挑战... 9

1.4.2 微藻产油的主要挑战... 10

1.5 论文研究的目的及意义... 10

第2章 氮限制对蛋白核小球藻产氢产油的影响... 12

2.1 材料与方法... 12

2.1.1 藻种来源及培养条件... 12

2.1.2 仪器与试剂... 13

2.1.3 不同氮限制策略诱导蛋白核小球藻产氢产油... 14

2.1.4 细胞密度及叶绿素含量的测定... 15

2.1.5 气体成分分析... 16

2.1.6 叶绿素荧光参数的测定... 16

2.1.7 总脂含量的测定... 16

2.2 结果与讨论... 17

2.2.1 氮限制诱导产氢产油过程中蛋白核小球藻的生长情况... 17

2.2.2 不同氮限制策略下蛋白核小球藻产氢产油能力的比较... 17

2.2.3 氮限制诱导产氢产油过程中蛋白核小球藻叶绿素荧光参数的变化... 19

2.3 本章小结... 22

第3章 碳源对蛋白核小球藻生长及产氢产油的影响... 23

3.1 材料与方法... 23

3.1.1 不同碳源对蛋白核小球藻生长的影响... 23

3.1.2 添加不同浓度的乙酸诱导蛋白核小球藻产氢产油... 23

3.1.3 呼吸速率及光合放氧速率测定... 23

3.1.4 其他分析方法... 24

3.1.5 脂质组分析... 24

3.2 结果与讨论... 24

3.2.1 不同碳源对蛋白核小球藻生长的影响... 24

3.2.2 不同浓度的外源乙酸对蛋白核小球藻产氢产油能力的影响... 26

3.2.3 乙酸对蛋白核小球藻脂肪酸组成的影响... 28

3.2.4 添加不同浓度乙酸诱导产氢产油过程中蛋白核小球藻叶绿素荧光参数的变化... 29

3.2.5 乙酸对蛋白核小球藻产氢产油过程中光合放氧速率和呼吸速率的影响... 30

3.3 本章小结... 32

第4章 乙酸促进蛋白核小球藻产氢产油的调控机制研究... 33

4.1 材料与方法... 33

4.1.1 收取样品... 33

4.1.2 转录组学分析... 33

4.1.3 光合及呼吸代谢途径抑制剂处理蛋白核小球藻... 34

4.1.4 相关分析方法... 34

4.2 结果与讨论... 34

4.2.1 转录组分析概况... 34

4.2.2 抑制特定代谢途径对蛋白核小球藻产氢产油的影响... 46

4.3 本章小结... 51

第5章 结论与展望... 52

5.1 结论... 52

5.2 展望... 53

参考文献... 54

附录 论文中主要缩写及对照... 60

致谢... 62

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 63