近年来，塑料凭借质轻耐用、成本低廉等优势，已广泛应用于现代生活的各个领域。然而，随着塑料消费量的持续攀升，大量废弃塑料对环境和生物多样性造成了严重威胁。传统的塑料处置方式，如焚烧、填埋及化学回收，普遍存在二次污染、高成本等问题。在此背景下，微生物降解技术凭借其环保、可持续的优势，已成为塑料污染防控领域的研究重点与发展方向。实验室前期从潮间带塑料垃圾中分离获得一株海洋真菌Alternaria alternata FB1，研究证实该菌株能够高效定殖于聚乙烯（PE）塑料表面，并通过分泌降解酶实现PE的有效解聚。此外，其降解酶也被证实对可降解塑料，如聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（PBAT）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）和聚己内酯（PCL）有较强的降解活性。为进一步探究该菌株对更广泛塑料底物的降解潜力，本研究围绕聚氨酯（PU）与聚丙烯（PP）两类典型难降解塑料开展生物降解研究。

在实验室前期工作基础上，本研究综合运用转录组学、分子生物学与酶工程技术，筛选并表征菌株FB1中介导PU和PP降解的核心功能酶。由于该菌株遗传背景尚不明确，现有研究存在组学解析受限、缺乏遗传与表型层面直接佐证等不足。为此，本研究首先开展了该菌株遗传操作系统的构建，通过条件优化成功制备出高质量原生质体，并建立了聚乙二醇（PEG）介导的高效原生质体转化体系。在此基础上，进一步构建了质粒随机插入真菌突变体库与基因敲除技术体系。上述工作可为后续PU和PP降解关键基因的筛选、功能酶鉴定及降解机制的遗传学验证提供坚实的技术支撑。

PU凭借优异的理化性能，广泛应用于医疗、交通、电子电器等诸多领域，但其结构稳定性强，在自然环境中难以自然降解，易造成长期环境负担。前期研究证实，菌株FB1对PU薄膜具有较强的降解能力，然而调控该过程的关键功能降解酶仍未明确。本研究依托菌株FB1成熟的遗传操作体系，从随机突变体库中筛选得到两株PU降解能力显著下降的突变株A1与A76，并利用热不对称交错PCR（TAIL‑PCR）精准鉴定外源片段插入位点。以上述突变株为研究切入点，结合PU诱导条件下野生型与突变株的转录组差异分析，筛选出4个转录水平显著下调的潜在PU降解角质酶，依次命名为AaCut1、AaCut4、AaCut5和AaCut10。体外功能验证结果表明，AaCut4、AaCut5与AaCut10 均能够有效降解商用水性聚氨酯Impranil‑DLN‑SD，其中AaCut10降解活性最为突出。在37 ℃温和静置条件下，该酶可在10 min内实现水性聚氨酯的完全降解。进一步试验证实，AaCut10对结构更为复杂的聚酯型PU泡沫同样具备降解效能，处理2天后，泡沫材料降解率可达36.75%，材料纤维结构发生明显破损与瓦解。结合傅里叶变换红外光谱、凝胶渗透色谱及降解产物组分分析可知，AaCut10主要靶向聚酯链段中的酯键，通过高效水解断裂酯键，促使高分子聚酯链发生解聚。该酶降解PU 的最终产物主要为己二酸、二甘醇等小分子单体，可为废弃聚氨酯的资源化回收与绿色工业化处置提供重要理论依据与功能酶资源支撑。

相较于PU，PP作为典型聚烯烃类塑料，化学结构高度稳定，天然抗生物降解能力更强。PP产量大、回收利用率低，二者失衡使其对生态环境造成严重威胁。而现有PP生物降解技术大多依赖预处理工序，普遍存在成本高、降解效率低的现实瓶颈。为突破这一局限，本研究以可直接降解未经预处理PP的菌株FB1为研究对象，多角度表征其PP降解能力，并解析其降解机制。研究发现，该菌株可有效定殖于PP薄膜表面并形成密集降解孔洞。经7周孵育后，PP膜重均分子量降幅达65%，主要结晶峰强度下降约90%，证明该菌株可显著破坏PP聚合物内部结构。结合转录组学分析、体外酶活验证及关键基因敲除试验，证实一种拜耳-维立格单加氧酶（BVMO）和一种过氧化氢-过氧化物酶（KatG）具备PP降解活性。基于此，本研究提出了菌株FB1降解利用PP的机制模型，为后续PP生物降解研究提供了重要的理论参考。

综上所述，本研究以海洋真菌A. alternata FB1 为研究对象，系统解析了该菌株及其关键降解酶对PU与PP的降解特征与作用机制。本研究不仅丰富了降解 PU、PP 的微生物资源与降解酶系，也为塑料的绿色无害化处理及工业化降解应用提供了重要理论依据与技术参考。未来可结合蛋白质工程、多酶协同复合体系构建等策略，进一步提升塑料降解效率，以期为缓解全球塑料污染难题提供新思路与可行方案。

第1章 绪论... 1

1.1 塑料污染全球现状... 1

1.1.1 塑料的种类与性质... 1

1.1.2 塑料污染的危害... 2

1.1.3 塑料废弃物的处理方法... 4

1.2 聚氨酯塑料... 5

1.2.1 聚氨酯塑料的分类与性质... 5

1.2.2 聚氨酯废弃物回收与生物降解... 5

1.3 聚丙烯塑料... 7

1.3.1 聚丙烯的理化性质与应用... 7

1.3.2 聚丙烯废弃物的回收与生物降解... 8

1.4 Alternaria alternata与塑料降解... 11

1.5 研究内容及意义... 13

第2章 海洋真菌Alternaria alternata FB1遗传操作系统的构建... 15

2.1 前言... 15

2.2 实验材料与方法... 16

2.2.1 实验材料与试剂... 16

2.2.2 菌株与质粒... 16

2.2.3 培养基... 16

2.2.4 A. alternata FB1原生质体的制备... 17

2.2.5 筛选抗生素浓度的确定... 17

2.2.6 A. alternata FB1转化方法的建立... 18

2.2.7 构建A. alternata FB1的突变体库... 18

2.2.8 A. alternata FB1基因敲除株的构建... 19

2.3 实验结果... 20

2.3.1 酶解法制备A. alternata FB1高质量原生质体... 20

2.3.2 菌株FB1对潮霉素B和G418的敏感性... 21

2.3.3 构建基于pCT74质粒转化的突变体库... 22

2.3.4 A. alternata FB1的高效率敲除策略... 24

2.4 讨论... 27

2.5 本章小结... 29

第3章 基于突变体库筛选海洋真菌A. alternata FB1聚氨酯降解酶... 31

3.1 前言... 31

3.2 实验材料与方法... 32

3.2.1 实验材料与试剂... 32

3.2.2 培养基... 32

3.2.3 聚酯型聚氨酯膜真菌降解能力评估... 33

3.2.4 聚氨酯降解减弱株筛选与插入位点鉴定... 33

3.2.5 插入位点及相关基因的遗传学验证... 34

3.2.6 降解减弱株的转录组测定与分析... 34

3.2.7 潜在聚氨酯降解角质酶的蛋白表达纯化... 34

3.2.8 潜在聚氨酯降解酶的水性聚氨酯降解活性测定... 36

3.2.9 AaCut10对水性聚氨酯的降解理化性质测定... 36

3.2.10 AaCut10对聚酯型聚氨酯泡沫材料的解聚... 37

3.3 实验结果... 38

3.3.1 筛选到两株聚氨酯降解能力显著减弱的A. alternata FB1突变体... 38

3.3.2 突变体插入位点检测及遗传学验证... 40

3.3.3 突变体降解聚氨酯的转录组学分析... 43

3.3.4 AaCut10催化水性聚氨酯的水解... 44

3.3.5 AaCut10催化聚酯型聚氨酯泡沫的水解... 48

3.4 讨论... 53

3.4.1 降解减弱株的遗传机制解析与潜在应用价值... 53

3.4.2 聚氨酯降解角质酶的蛋白质工程改造与工业化应用前景... 54

3.5 本章小节... 56

第4章 海洋真菌A. alternata FB1的聚丙烯降解过程及机制研究... 57

4.1 前言... 57

4.2 实验材料与方法... 58

4.2.1 聚丙烯材料来源及预处理方式... 58

4.2.2 实验试剂及培养基... 58

4.2.3 A. alternata FB1与聚丙烯共孵育方法... 58

4.2.4 聚丙烯降解前后理化性质测定... 59

4.2.5 降解产物气相色谱-质谱（GC-MS）分析... 60

4.2.6 转录组测定与分析... 61

4.2.7 聚丙烯降解酶的体外表达、纯化与降解活性检测... 61

4.2.8 聚丙烯降解酶敲除株的构建... 62

4.3 实验结果... 62

4.3.1 A. alternata FB1对聚丙烯薄膜的定殖及降解情况... 62

4.3.2 降解前后聚丙烯塑料理化性质的变化情况... 65

4.3.3 降解产物的GC-MS分析... 72

4.3.4 聚丙烯降解过程的真菌转录组分析... 73

4.3.5 聚丙烯降解酶的体外表达与活性检测... 76

4.3.6 关键聚丙烯降解酶敲除株的构建及其降解能力检测... 79

4.4 讨论... 81

4.4.1 菌株FB1降解聚丙烯的推测模型... 81

4.4.2 多基因编辑破解功能冗余瓶颈... 83

4.4.3 多酶协同网络提升降解效率... 84

4.4.4 合成生物学构建“超级降解菌株”. 84

4.5 本章小结... 86

第5章 总结与展望... 89

参考文献... 93

附录  本研究使用的引物序列... 105

致谢... 113

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 115