美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp. piscicida，PDP）属革兰氏阴性菌，是导致全球水产养殖业重大经济损失的主要致病菌之一。该病原可感染包括许氏平鲉（Sebastes schlegelii）和花鲈（Lateolabrax maculatus）在内的多种海洋经济鱼类，引发以全身性菌血症和内脏白色结节为特征的发光杆菌病（Photobacteriosis）。细胞焦亡是由Gasdermin（GSDM）家族蛋白介导的程序性细胞死亡，其通常由Caspase（CASP）激活，在宿主抗感染免疫中发挥关键作用。目前，许氏平鲉和花鲈等重要海水养殖鱼类的细胞焦亡尚缺乏研究，其是否受PDP调控也未知。基于此，本论文旨在以许氏平鲉和花鲈为研究对象，利用分子生物学、细胞生物学、生物化学以及生物信息学等技术，揭示PDP诱导的鱼类细胞焦亡的分子机制。主要研究结果如下：

（1）从许氏平鲉中鉴定获得两个GSDM E（GSDME）同源基因（SsGSDMEa和SsGSDMEb）及三种CASP（SsCASP3、SsCASP9和SsCASP10）。三种CASP皆能诱导细胞凋亡。两种GSDME中，SsGSDMEa具备诱导焦亡活性，SsGSDMEb则无此功能。SsCASP3在261NVVD264位点切割SsGSDMEa，产生具有焦亡活性的N端片段NT264。SsCASP9和SsCASP10分别于203IESD206和246IEAD249位点切割SsGSDMEa，产生两个N端片段－NT206和NT249，其中NT249具有焦亡活性，而NT206不能诱导焦亡。体内感染实验发现，PDP感染显著诱导许氏平鲉SsGSDMEa及SsCASP3/9/10的表达与激活，最终引发细胞焦亡。

（2）在花鲈中鉴定获得两个GSDME同源基因（LmGSDMEa和LmGSDMEb）及三种CASP（LmCASP3、LmCASP6和LmCASP7）。LmCASP3和LmCASP7可直接诱导细胞凋亡，并特异性切割LmGSDMEa的262NTVD265位点，产生具有焦亡活性的N端片段NT265，将凋亡转换为焦亡；而LmCASP6既不诱导凋亡，也不切割LmGSDMEa。体内感染实验发现，PDP感染可上调花鲈组织中LmCASP3/7、LmGSDMEa及焦亡相关炎性细胞因子的表达，并在巨噬细胞中激活LmGSDMEa的剪切，进而启动细胞焦亡进程。

（3）筛选出一种PDP溶血素（PdpH1），其含有SGNH水解酶结构域，能够破坏鱼类红细胞及巨噬细胞。PdpH1可激活许氏平鲉巨噬细胞中的SsGSDMEa及SsCASP3/9，以及花鲈巨噬细胞中的LmGSDMEa及LmCASP3，因此调控细胞焦亡。PdpH1的细胞焦亡诱导活性严格依赖其核心亲核催化残基Ser142。

综上所述，本研究率先发现PDP诱导鱼类细胞焦亡，揭示了PDP诱导的许氏平鲉和花鲈细胞焦亡机制，明确了一个PDP毒力因子通过激活宿主CASP-GSDMEa轴诱导焦亡的分子机制。研究结果丰富了对硬骨鱼类细胞焦亡调控机制以及PDP毒力机制的认知，也为以焦亡通路为靶点的鱼类病害防控策略开发奠定了理论基础。

第1章 绪论 1

1.1 许氏平鲉和花鲈的养殖现状 1

1.1.1 许氏平鲉 1

1.1.2 花鲈 1

1.1.3 细菌性病害及其产业危害 2

1.2 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种 2

1.2.1 分类地位与病原学特征 2

1.2.2 流行病学与致病性 3

1.3 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的毒力因子与致病机制 3

1.3.1 铁摄取系统 3

1.3.2 血清补体抗性 4

1.3.3 磷脂酶A2 4

1.3.4 金属蛋白酶AIP56 5

1.3.5 外膜囊泡 5

1.4 程序性细胞死亡 6

1.4.1 程序性细胞死亡概述 6

1.4.2 细胞焦亡 7

1.4.3 细胞焦亡在硬骨鱼中的研究现状 10

1.5 本研究的目的和意义 11

第2章 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种诱导的许氏平鲉细胞焦亡机制 12

2.1 前言 12

2.2 实验材料与方法 12

2.2.1 实验动物与细胞系 12

2.2.2 实验菌株 13

2.2.3 实验试剂与仪器 14

2.2.4 序列获取与系统发育分析 15

2.2.5 细菌侵染实验 16

2.2.6 许氏平鲉RNA提取与逆转录 17

2.2.7 生理条件下SsGSDMEa/b的组织表达谱 19

2.2.8 细菌感染条件下SsGSDMEa/b与SsCASP3/9/10表达水平 20

2.2.9 载体构建、蛋白表达与纯化 20

2.2.10 SsGSDMEa定点突变 24

2.2.11 SsGSDMEa/b与SsCASP3/9/10重组蛋白的体外表达与纯化 24

2.2.12 HEK293T细胞蛋白异源表达 25

2.2.13 免疫印迹 27

2.2.14 细胞形态学观察 27

2.2.15 Caspase酶活及底物偏好性检测 28

2.2.16 SsGSDMEa和PARP1与SsCASP3/9/10的体外剪切 29

2.2.17 乳酸脱氢酶检测 30

2.3 实验结果 30

2.3.1 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染诱导许氏平鲉巨噬细胞发生焦亡样细胞死亡 30

2.3.2 许氏平鲉GSDME同源基因的鉴定与功能特征分析 31

2.3.3 SsGSDMEa-NTD诱导HEK293T细胞焦亡 34

2.3.4 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染诱导SsGSDMEa的剪切激活 34

2.3.5 SsGSDMEa在许氏平鲉各组织的表达模式 35

2.3.6 SsCASP3/9/10诱导HEK293T细胞凋亡 36

2.3.7 SsCASP3/9/10对SsGSDMEa具备剪切活性 40

2.3.8 SsCASP3与SsCASP9/10在不同位点剪切SsGSDMEa 41

2.3.9 SsCASP3/9/10对SsGSDMEa的激活导致细胞死亡由凋亡转向焦亡 42

2.3.10 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染通过SsCASP3/9/10-GSDMEa通路激活许氏平鲉细胞焦亡 44

2.4 讨论 46

第3章 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种诱导花鲈GSDMEa介导的细胞焦亡机制 49

3.1 前言 49

3.2 实验材料与方法 49

3.2.1 实验动物与细胞系 49

3.2.2 实验菌株 49

3.2.3 实验试剂与仪器 50

3.2.4 序列获取与系统发育分析 50

3.2.5 细菌侵染实验 50

3.2.6 花鲈RNA提取与逆转录 51

3.2.7 生理条件下LmGSDMEa/b的组织表达谱 51

3.2.8 细菌感染条件下LmGSDMEa/b、LmCASP3/7及炎症因子表达水平 51

3.2.9 载体构建、蛋白表达与纯化 51

3.2.10 LmGSDMEa定点突变 53

3.2.11 LmCASP3/6/7重组蛋白的体外表达与纯化 53

3.2.12 HEK293T细胞蛋白异源表达 53

3.2.13 免疫印迹 54

3.2.14 细胞形态学观察 54

3.2.15 Caspase酶活检测 54

3.2.16 LmCASP3/6/7的体外剪切LmGSDMEa与DFF45 55

3.2.17 LDH检测 55

3.3 实验结果 55

3.3.1 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染诱导花鲈巨噬细胞发生焦亡样细胞死亡 55

3.3.2 花鲈GSDME的鉴定与序列分析 56

3.3.3 LmGSDMEa-NTD诱导HEK293T细胞焦亡 59

3.3.4 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染诱导LmGSDMEa剪切激活 59

3.3.5 LmGSDMEa/b在花鲈各组织的表达模式 60

3.3.6 LmCASP3/7诱导细胞凋亡 61

3.3.7 LmCASP3/7能够剪切LmGSDMEa 64

3.3.8 LmCASP3/7在262NTVD265位点剪切LmGSDMEa 64

3.3.9 LmCASP3/7对LmGSDMEa的激活介导细胞从凋亡向焦亡的转换 65

3.3.10 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染诱导花鲈焦亡通路关键分子以及炎症因子表达 67

3.4 讨论 69

第4章 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种PdpH1的毒力机制 72

4.1 前言 72

4.2 实验材料与方法 72

4.2.1 实验动物与细胞 72

4.2.2 实验菌株 73

4.2.3 实验试剂与仪器 73

4.2.4 细菌DNA提取 74

4.2.5 细菌敲除株构建 74

4.2.6 细菌侵染 75

4.2.7 序列获取与系统发育分析 76

4.2.8 载体构建、蛋白表达与纯化 76

4.2.9 PdpH1的定点突变 76

4.2.10 PdpH1及其S142A突变体重组蛋白的表达与纯化 76

4.2.11 溶血实验 77

4.2.12 PdpH1及其S142A突变体重组蛋白对原代细胞的毒性检测 78

4.2.13 免疫印迹 78

4.2.14 细胞形态学观察 78

4.2.15 LDH检测 78

4.3 实验结果 79

4.3.1 溶血素基因在美人鱼发光杆菌杀鱼亚种诱导宿主细胞死亡中的作用 79

4.3.2 PdpH1的序列特征 80

4.3.3 PdpH1的溶血活性 82

4.3.4 PdpH1诱导许氏平鲉与花鲈细胞焦亡 83

4.3.5 PdpH1诱导宿主细胞死亡的活性依赖其Ser142位点 85

4.4 讨论 87

第5章 结论与展望 89

参考文献 91

附录一 常用试剂配方 99

附录二 实验引物序列 100

致谢 105

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 107