程序性细胞死亡在维持机体发育、组织稳态以及宿主免疫防御过程中发挥重要作用。细胞焦亡与凋亡性坏死属于典型的裂解性程序性细胞死亡方式，其共同特征是通过破坏细胞膜完整性，释放炎症介质和细胞内容物，从而调控免疫应答。细胞焦亡由焦孔素（gasdermin, GSDM）家族蛋白介导，当炎性或凋亡相关caspase剪切GSDM蛋白后，其N端结构域释放，并在细胞膜上形成穿膜孔道，最终导致细胞裂解。与焦亡不同，凋亡性坏死依赖受体相互作用蛋白激酶（receptor Interacting protein kinase, RIPK）及混合谱系激酶样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL）。RIPK1与RIPK3互作形成激酶复合物，磷酸化修饰MLKL蛋白，活化的MLKL通过寡聚化插入细胞膜形成孔道，最终介导细胞裂解。在病原感染过程中，这两种裂解性细胞死亡通路能够迅速清除被感染细胞，从而在宿主抗感染免疫中发挥重要作用。然而，裂解性细胞死亡调控机制研究主要集中于人类、小鼠等哺乳动物，鱼类作为演化早期出现的脊椎动物，其细胞焦亡与凋亡性坏死调控机制仍有待深入研究；此外，两条细胞死亡通路是否存在协同调控尚不清楚。

本研究首先围绕鱼类细胞焦亡调控机制展开深入研究。通过生物信息学分析与功能实验相结合的方式，对GSDM家族成员进行了系统鉴定与比较研究。结果表明，绝大部分鱼类普遍具有两种GSDME亚型，命名为GSDMEa与GSDMEb。进一步研究发现，加拿大底鳉等小部分鱼类中还存在一种新的GSDME同源物，命名为GSDMEc。功能实验显示，加拿大底鳉三种GSDME蛋白均能够通过其N端结构域介导细胞焦亡，其特征包括细胞膜破裂、细胞内容物释放及细胞快速裂解，表明GSDM介导的膜成孔杀伤机制在脊椎动物演化过程中具有较高的保守性。进一步研究发现，不同GSDME同源物在调控方式上存在明显差异。其中，GSDMEa可被炎性caspase-1以及凋亡相关caspase-3/7剪切激活，而GSDMEb则可被caspase-1以及caspase-3/7/8剪切激活，GSDMEc主要依赖凋亡相关的caspase-7特异性剪切激活。剪切后释放的GSDME N端结构域能够在细胞膜上形成孔道，造成细胞渗透压失衡，细胞最终裂解死亡。此外，本研究发现，GSDMEb的N端结构域能够直接破坏细菌细胞膜。功能位点分析表明，三种GSDME蛋白N端结构域均具有保守的成孔关键残基，但其C端自抑制结构域的功能位点存在明显差异，表明鱼类GSDME具有多样化的调控机制，介导细胞焦亡。与加拿大底鳉不同，本研究发现剑尾鱼也具有GSDMEc同源蛋白，该蛋白可被caspase-3特异性剪切。然而，剪切发生在GSDMEc蛋白的N端结构域内部，从而产生不完整的N端片段，破坏其成孔活性，阻断焦亡发生。上述结果表明，鱼类GSDM家族蛋白具有保守的膜穿孔功能，却形成了差异化的剪切调控模式，为理解细胞焦亡在脊椎动物中的演化提供了理论依据。

在鱼类凋亡性坏死方面，本研究解析了鱼类凋亡性坏死执行蛋白MLKL的膜穿孔机制。MLKL是凋亡性坏死的核心执行分子，其通过寡聚化插入细胞膜形成跨膜孔道，从而破坏膜完整性，并介导裂解性细胞死亡。然而，相较于哺乳动物，鱼类MLKL膜穿孔的结构基础及其作用机制仍不清楚。为此，本研究通过结构与功能分析，深入探究了半滑舌鳎MLKL的膜破坏机制。结果表明，MLKL可在不依赖支撑区域的情况下被激活，其N端四螺旋束（4HB）结构域即可驱动膜穿孔，并介导裂解性细胞死亡。该膜破坏过程依赖于N端结构的完整性，当该区域发生缺失时，即使MLKL仍可形成寡聚体，其膜裂解活性仍显著降低。理化性质分析显示，该区域具有明显的两亲性螺旋结构，其中正电荷分布与疏水残基共同参与质膜破裂过程。功能实验进一步表明，MLKL N端结构域不仅能够介导真核细胞膜破裂，还表现出类似抗菌肽的膜破坏活性，能够直接破坏细菌细胞膜，具有杀菌功能，表明鱼类MLKL具有保守的膜穿孔功能。同时，研究发现不同脊椎动物MLKL同源蛋白在N端区域呈现显著的理化性质差异，尤其在电荷分布和两亲性特征方面存在明显不同，暗示不同物种MLKL具有差异化的结构基础。进一步研究发现，凋亡相关调控蛋白caspase-7能够与GSDME及MLKL相互作用，分别激活细胞焦亡与凋亡性坏死，暗示细胞焦亡与凋亡性坏死通路之间存在cross-talk，协同调控泛凋亡。

综上，本研究从系统演化与免疫功能两个层面探究了鱼类焦亡与凋亡性坏死调控机制，揭示了GSDM与MLKL介导细胞裂解死亡的分子机制与结构基础，阐明了GSDM蛋白与MLKL蛋白保守的膜穿孔功能及其独特的调控机制，明确了caspase作为信号转导枢纽因子，协同调控焦亡与凋亡性坏死通路，驱动泛凋亡。研究结果不仅拓展了人们对脊椎动物程序性细胞死亡演化机制的认识，也为鱼类抗感染免疫及疫病防控提供了理论依据。

第1章 绪论... 1

1.1 细胞凋亡... 2

1.1.1 细胞凋亡介绍... 2

1.1.2 细胞凋亡调控机制... 2

1.1.3 细胞凋亡免疫功能... 4

1.1.4 鱼类细胞凋亡及其免疫调控... 5

1.2 细胞焦亡... 6

1.2.1 细胞焦亡简介... 6

1.2.2 细胞焦亡调控机制... 6

1.2.3 细胞焦亡免疫功能... 9

1.2.4 鱼类细胞焦亡及其免疫调控... 11

1.3 凋亡性坏死... 13

1.3.1 凋亡性坏死介绍... 13

1.3.2 凋亡性坏死调控机制... 13

1.3.3 凋亡性坏死免疫功能... 16

1.3.4 鱼类凋亡性坏死及其免疫调控... 18

1.4 泛凋亡... 19

1.4.1 泛凋亡介绍... 19

1.4.2 泛凋亡调控机制... 20

1.4.3 泛凋亡免疫功能... 23

1.4.4 鱼类泛凋亡及其免疫调控... 23

1.5 本研究的目的与意义... 26

第2章 鱼类新型焦孔素介导细胞焦亡调控机制研究... 27

2.1 前言... 27

2.2 材料与方法... 28

2.2.1 细胞与菌株... 28

2.2.2 试剂与仪器... 28

2.2.3 序列分析... 30

2.2.4 基因合成... 32

2.2.5 载体构建... 32

2.2.6 突变体构建... 37

2.2.7 无内毒素质粒提取... 40

2.2.8 细胞转染... 41

2.2.9 重组蛋白表达与纯化... 42

2.2.10 显微观察与成像... 42

2.2.11 扫描电子显微术... 43

2.2.12 乳酸脱氢酶检测... 43

2.2.13 细胞毒性及抑菌实验... 44

2.2.14 Caspase酶活测定... 44

2.2.15 免疫印迹实验... 44

2.2.16 Caspase体外剪切GSDME实验... 45

2.3 实验结果... 46

2.3.1 加拿大底鳉具有三种GSDME同源蛋白... 46

2.3.2 加拿大底鳉GSDMEa N端结构域能介导细胞焦亡... 48

2.3.3 Caspase-1/3/7剪切激活加拿大底鳉GSDMEa. 51

2.3.4 加拿大底鳉GSDMEb N端能够介导焦亡并导致细菌破裂... 55

2.3.5 Caspase-1/3/7/8剪切激活加拿大底鳉GSDMEb. 57

2.3.6 加拿大底鳉GSDMEc N端介导细胞焦亡... 60

2.3.7 Caspase-7特异性剪切激活加拿大底鳉GSDMEc. 62

2.3.8 加拿大底鳉GSDMEa/b具有保守的N端功能残基... 64

2.3.9 加拿大底鳉GSDMEa/b/c的C端自抑制关键残基存在差异... 68

2.3.10 剑尾鱼具有GSDMEc同源物... 71

2.3.11 剑尾鱼GSDMEc通过N端结构域介导焦亡... 73

2.3.12 Caspase-3剪切剑尾鱼GSDMEc，破坏了N端完整性... 74

2.3.13 Caspase-3剪切剑尾鱼GSDMEc抑制焦亡... 76

2.4 讨论... 78

第3章 鱼类MLKL穿膜功能及其调控机制研究... 83

3.1 前言... 83

3.2 材料与方法... 84

3.2.1 细胞与菌株... 84

3.2.2 试剂与仪器... 84

3.2.3 序列分析... 84

3.2.4 分子克隆... 85

3.2.5 载体构建... 85

3.2.6 突变体构建... 85

3.2.7 细胞转染... 87

3.2.8 显微观察与成像... 87

3.2.9 乳酸脱氢酶检测... 87

3.2.10 细胞毒性实验... 87

3.2.11 寡聚化检测... 87

3.2.12 免疫印迹实验... 87

3.2.13 抗菌肽杀菌实验... 88

3.3 实验结果... 88

3.3.1 支撑区域并非MLKL介导细胞死亡所必需... 88

3.3.2 4HB区域是MLKL寡聚化及膜裂解的关键结构域... 92

3.3.3 第一段α螺旋结构对4HB区域的膜破坏功能至关重要... 99

3.3.4 4HB的两亲性决定了人MLKL的脂膜裂解能力... 103

3.3.5 半滑舌鳎MLKL两亲性4HB区域具有不同的结构基础... 108

3.3.6 脊椎动物MLKL N端螺旋结构差异显著... 114

3.3.7 半滑舌鳎MLKL具有保守的功能位点... 116

3.4 讨论... 119

第4章 鱼类焦亡与凋亡性坏死通路互作机制初探... 123

4.1 前言... 123

4.2 材料与方法... 124

4.2.1 细胞与菌株... 124

4.2.2 试剂与仪器... 124

4.2.3 分子克隆... 124

4.2.4 定点突变... 124

4.2.5 无内毒素质粒提取... 125

4.2.6 Caspase酶活测定... 125

4.2.7 免疫印迹实验... 125

4.2.8 Caspase体外剪切GSDME及MLKL实验... 125

4.2.9 细胞转染... 125

4.2.10 显微观察与成像... 126

4.3 实验结果... 126

4.3.1 Caspase-6/7剪切激活半滑舌鳎MLKL.. 126

4.3.2 Caspase-1/3/7剪切激活半滑舌鳎GSDMEa. 128

4.3.3 Caspase-7分别与MLKL、GSDME相互作用... 131

4.3.4 半滑舌鳎caspase-7激活MLKL与GSDME，诱导细胞死亡... 133

4.3.5 半滑舌鳎caspase-7/MLKL/GSDME三者相互作用... 135

4.4 讨论... 137

第5章 结论与展望... 141

5.1 结论... 141

5.2 创新点... 142

5.3 展望与不足... 143

参考文献... 145

附录一 Weblogo蛋白序列编号... 161

附录二 常用试剂配方... 169

致谢... 171

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 173