硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）作为一种糖胺聚糖，广泛分布于动物 组织的细胞外基质以及细胞表面，并在生物体内承担多种重要的生理功能。在临 床上，CS 被广泛应用于关节疾病的辅助治疗，发挥缓解疼痛、促进软骨组织修 复的作用。CS由葡萄糖醛酸与N-乙酰半乳糖胺通过β-1,4糖苷键交替相连构成， 根据N-乙酰半乳糖胺上的硫酸基团修饰位置不同，CS可进一步划分为多种亚型， 包括硫酸软骨素A（CSA）、硫酸软骨素C（CSC）以及硫酸软骨素E（CSE） 等。陆地来源的生物软骨中以CSA为主，海洋来源的软骨鱼中以CSC为主。不 同类型的硫酸软骨素在生物学活性上存在显著差异，其中，CSC在细胞增殖、骨 细胞分化以及神经元可塑性等方面具有独特的生物学活性。 目前，硫酸软骨素主要从动物软骨组织中直接提取，该方法制备的硫酸软骨 素聚合度和硫酸化修饰方式均不可控，直接影响其生物学活性。此外，采用动物 组织提取法制备的硫酸软骨素，纯度较低，常混杂其他糖胺聚糖，不仅会导致产 品功效降低，还可能诱发免疫反应，严重时甚至危及生命安全。因此，合成高纯 度的、修饰方式单一的硫酸软骨素对于拓展其临床应用、开发新功能尤为关键。 生物合成法制备的CS产物单一且硫酸化修饰方式固定，能够有效避免上述问题。 目前，CSA生物合成途径已被广泛研究，然而，CSC生物合成途径却鲜有报道， 特别是软骨素6位硫酸基转移酶(Chondroitin-6-sulfotransferase，C6ST)作为 CSC生物合成的关键酶，其基因挖掘和表达特性研究不足，严重制约了CSC生物合 成途径的构建。本论文针对CSC生物合成途径建立开展研究，首先构建了CSC合成反应中硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)合成系统。随后，从条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum，C. plagiosum）基因组中挖掘到两种C6ST 基因， 并进一步优化了其体外表达与纯化条件。最后，整合PAPS合成系统及C6ST表达系统成功体外合成高纯度的、修饰方式单一的CSC。具体研究结果如下： （1）PAPS是CSC合成过程中硫酸基团的直接供体，已报道ATP硫酸化酶 （ATPS）和APS激酶（APSK）能够体外合成PAPS。ATPS以三磷酸腺苷（ATP） 为底物合成三磷酸硫酸腺苷（APS），再经APSK催化合成PAPS。本研究分别 将ATPS和APSK在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）BL21(DE3)中表达，优 化获得了可溶性表达的条件。随后，经金属亲和层析和分子排阻层析的纯化步骤 获得ATPS和APSK蛋白。然而体外PAPS合成反应表明，由于ATPS和APSK 的酶活较低，合成的PAPS 物质量较少，无法用于后续的CSC合成反应中。因 此，需要建立更稳定、活性高的PAPS合成路径。 （2）酰基硫酸转移酶（Aryl sulfotransferase IV，ASSTIV）可以催化3’-5’二磷酸腺苷（3’-phosphoadenosine-5’-phosphate，PAP）通过一步反应生成 PAPS。通过克隆获得鼠源ASSTIV基因，并以pET28a为载体在E. coli BL21 中表达，经金属亲和层析和分子排阻层析纯化步骤获得大量可溶表达的ASSTIV蛋白，且体 外催化实验表明，制备的ASSTIV蛋白具有PAPS的合成活性。 （3）C6ST 是 CSC 生物合成的关键酶，直接催化硫酸基团从供体PAPS转移至受体软骨素，生成 CSC。本研究从条纹斑竹鲨基因组中挖掘到 C6ST1 和 C6ST7 基因并进一步开展了体外表达研究。将上述基因分别在E. coli、毕赤酵母 （Pichia pastoris，P. pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae） 等表达系统中表达。结果显示，当以T7作为启动子，在E. coli系统中表达时， C6ST1 和 C6ST7 均以包涵体形式表达。对上述蛋白进行截短处理后，并在其N 端融合麦芽糖结合蛋白标签（Maltose binding protein，MBP），可成功实现C6ST1 与C6ST7的可溶性表达。此外，在P. pastoris表达系统中两种蛋白均无法实现表达，而在S. cerevisiae 中，以GAL1为启动子，C6ST1和C6ST7全长形式的蛋白均可获得可溶表达。综合考虑蛋白纯化质量和翻译后修饰因素，选择利用 S. cerevisiae 表达系统制备C6ST1和C6ST7用于后续的CSC体外合成途径。 （4）CSC体外合成途径建立。由于C6ST1的表达量大于C6ST7，本研究采用了S. cerevisiae 表达的 C6ST1，以软骨素为底物、以PAPS为硫酸基供体构建 体外合成体系，因此，于37℃催化反应48 h，合成产物经软骨素酶降解后由LC IT-TOF-MS 鉴定，结果表明体外制备的C6ST能够催化合成CSC。 综上所述，本论文首先对CSC生物合成的硫酸基供体PAPS的合成路径进 行研究，最终确定利用ASSTIV酶制备PAPS；随后，在条纹斑竹鲨基因组中挖 掘了C6ST1 和C6ST7 基因，并对其异源表达与纯化条件进行了筛选及优化；最 后，初步验证S. cerevisiae表达的C6ST1具有活性，能够在体外催化生成CSC。 本论文通过优化PAPS 合成和C6ST 制备等CSC 合成的关键步骤，成功建立了 CSC 的体外生物合成体系，对推动CSC在生物医药、功能材料等领域的开发与 应用具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

第1章 绪论... 1

1.1 硫酸软骨素概述... 1

1.1.1 硫酸软骨素的功能及应用... 1

1.2 硫酸软骨素的生产方式... 3

1.2.1 动物组织提取法... 3

1.2.2 化学合成法... 3

1.2.3 生物合成法... 4

1.2.4 硫酸软骨素生产方式对比... 4

1.3 硫酸软骨素生物合成的国内外研究进展... 5

1.3.1 软骨素的合成... 5

1.3.2 PAPS的合成... 5

1.3.3 硫酸转移酶的异源表达... 8

1.3.4 软骨素6-O-硫酸转移酶的研究进展... 8

1.4 本论文的立题背景和研究意义... 9

1.5 本论文的研究内容... 10

第2章 双酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸... 13

2.1 前言... 13

2.2 实验材料... 13

2.2.1 实验仪器... 13

2.2.2 质粒、引物及菌株... 14

2.2.3 试剂、药品与相关耗材... 14

2.2.4 培养基及溶液配制... 15

2.2.5 缓冲液... 15

2.3 实验方法... 16

2.3.1 ATP硫酸化酶和APS激酶基因筛选... 16

2.3.2 基因合成ATP硫酸化酶和APS激酶表达质粒... 16

2.3.3 质粒DNA的提取... 17

2.3.4 大肠杆菌化学转化法... 17

2.3.5 重组菌株的培养与表达... 17

2.3.6 重组蛋白的纯化与分析... 17

2.3.7 PAPS的合成与检测... 18

2.4 实验结果... 19

2.4.1 ATP硫酸化酶的试表达... 19

2.4.2 ATP硫酸化酶的大体积表达纯化... 20

2.4.3 APS激酶的表达纯化... 21

2.4.4 双酶法合成PAPS系统的构建... 22

2.5 讨论... 26

第3章 基于酰基硫酸转移酶单酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸... 29

3.1 前言... 29

3.2 实验材料... 29

3.2.1 实验仪器... 29

3.2.2 质粒、引物及菌株... 30

3.2.3 试剂、药品及耗材... 31

3.2.4 培养基及溶液配制... 31

3.2.5 缓冲液... 32

3.3 实验方法... 32

3.3.1 目的基因的优化和合成... 32

3.3.2 分子生物学方法... 32

3.3.3 扩增型大肠杆菌转化... 34

3.3.4 筛选阳性克隆... 34

3.3.5 质粒DNA的提取... 35

3.3.6 大肠杆菌化学转化法... 35

3.3.7 重组菌株的培养与表达... 35

3.3.8 重组蛋白的纯化与分析... 35

3.3.9 ASSTIV酶学性质表征... 36

3.4 实验结果... 36

3.4.1 酰基硫酸转移酶重组载体的构建... 36

3.4.2 酰基硫酸转移酶重组载体的诱导表达... 37

3.4.3 ASSTIV表达纯化及活性检测... 38

3.5 讨论... 40

第4章 鲨鱼源硫酸转移酶的异源表达... 43

4.1 引言... 43

4.2 实验材料... 43

4.2.1 实验仪器... 43

4.2.2 质粒、引物及菌株... 44

4.2.3 试剂、药品及耗材... 46

4.2.4 培养基及溶液配制... 47

4.2.5 缓冲液... 48

4.3 实验方法... 49

4.3.1 C6ST基因筛选... 49

4.3.2 大肠杆菌表达系统的构建... 49

4.3.3 毕赤酵母表达系统的构建... 49

4.3.4 酿酒酵母表达系统的构建... 53

4.3.5 重组蛋白的纯化与分析... 54

4.4 实验结果... 55

4.4.1 C6ST在E.coli BL21(DE3)中的表达... 55

4.4.2 C6ST在Pichia pastoris GS115中的表达... 59

4.4.3 C6ST在S. cerevisiae BY4742中的表达... 61

4.5 讨论... 64

第5章 C型硫酸软骨素的生物合成... 67

5.1 引言... 67

5.2 实验材料... 67

5.2.1 实验仪器... 67

5.2.2 试剂、药品及耗材... 68

5.3 实验方法... 68

5.3.1 软骨素裂解酶ABC表达... 68

5.3.2 硫酸软骨素合成体系配制... 68

5.3.3 硫酸软骨素二糖分析... 68

5.4 实验结果... 69

5.4.1 ChABC的表达... 69

5.4.2 CSC合成及酶解二糖衍生化... 70

5.4.3 CSC合成产物的LCMS-IF-TOF鉴定... 71

5.5 讨论... 72

第6章 主要结论与展望... 75

6.1 主要结论... 75

6.2 创新点... 75

6.3 展望... 76

参考文献... 77

致 谢... 87

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果软骨素概述... 1

1.1.1 硫酸软骨素的功能及应用... 1

1.2 硫酸软骨素的生产方式... 3

1.2.1 动物组织提取法... 3

1.2.2 化学合成法... 3

1.2.3 生物合成法... 4

1.2.4 硫酸软骨素生产方式对比... 4

1.3 硫酸软骨素生物合成的国内外研究进展... 5

1.3.1 软骨素的合成... 5

1.3.2 PAPS的合成... 5

1.3.3 硫酸转移酶的异源表达... 8

1.3.4 软骨素6-O-硫酸转移酶的研究进展... 8

1.4 本论文的立题背景和研究意义... 9

1.5 本论文的研究内容... 10

第2章 双酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸... 13

2.1 前言... 13

2.2 实验材料... 13

2.2.1 实验仪器... 13

2.2.2 质粒、引物及菌株... 14

2.2.3 试剂、药品与相关耗材... 14

2.2.4 培养基及溶液配制... 15

2.2.5 缓冲液... 15

2.3 实验方法... 16

2.3.1 ATP硫酸化酶和APS激酶基因筛选... 16

2.3.2 基因合成ATP硫酸化酶和APS激酶表达质粒... 16

2.3.3 质粒DNA的提取... 17

2.3.4 大肠杆菌化学转化法... 17

2.3.5 重组菌株的培养与表达... 17

2.3.6 重组蛋白的纯化与分析... 17

2.3.7 PAPS的合成与检测... 18

2.4 实验结果... 19

2.4.1 ATP硫酸化酶的试表达... 19

2.4.2 ATP硫酸化酶的大体积表达纯化... 20

2.4.3 APS激酶的表达纯化... 21

2.4.4 双酶法合成PAPS系统的构建... 22

2.5 讨论... 26

第3章 基于酰基硫酸转移酶单酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸... 29

3.1 前言... 29

3.2 实验材料... 29

3.2.1 实验仪器... 29

3.2.2 质粒、引物及菌株... 30

3.2.3 试剂、药品及耗材... 31

3.2.4 培养基及溶液配制... 31

3.2.5 缓冲液... 32

3.3 实验方法... 32

3.3.1 目的基因的优化和合成... 32

3.3.2 分子生物学方法... 32

3.3.3 扩增型大肠杆菌转化... 34

3.3.4 筛选阳性克隆... 34

3.3.5 质粒DNA的提取... 35

3.3.6 大肠杆菌化学转化法... 35

3.3.7 重组菌株的培养与表达... 35

3.3.8 重组蛋白的纯化与分析... 35

3.3.9 ASSTIV酶学性质表征... 36

3.4 实验结果... 36

3.4.1 酰基硫酸转移酶重组载体的构建... 36

3.4.2 酰基硫酸转移酶重组载体的诱导表达... 37

3.4.3 ASSTIV表达纯化及活性检测... 38

3.5 讨论... 40

第4章 鲨鱼源硫酸转移酶的异源表达... 43

4.1 引言... 43

4.2 实验材料... 43

4.2.1 实验仪器... 43

4.2.2 质粒、引物及菌株... 44

4.2.3 试剂、药品及耗材... 46

4.2.4 培养基及溶液配制... 47

4.2.5 缓冲液... 48

4.3 实验方法... 49

4.3.1 C6ST基因筛选... 49

4.3.2 大肠杆菌表达系统的构建... 49

4.3.3 毕赤酵母表达系统的构建... 49

4.3.4 酿酒酵母表达系统的构建... 53

4.3.5 重组蛋白的纯化与分析... 54

4.4 实验结果... 55

4.4.1 C6ST在E.coli BL21(DE3)中的表达... 55

4.4.2 C6ST在Pichia pastoris GS115中的表达... 59

4.4.3 C6ST在S. cerevisiae BY4742中的表达... 61

4.5 讨论... 64

第5章 C型硫酸软骨素的生物合成... 67

5.1 引言... 67

5.2 实验材料... 67

5.2.1 实验仪器... 67

5.2.2 试剂、药品及耗材... 68

5.3 实验方法... 68

5.3.1 软骨素裂解酶ABC表达... 68

5.3.2 硫酸软骨素合成体系配制... 68

5.3.3 硫酸软骨素二糖分析... 68

5.4 实验结果... 69

5.4.1 ChABC的表达... 69

5.4.2 CSC合成及酶解二糖衍生化... 70

5.4.3 CSC合成产物的LCMS-IF-TOF鉴定... 71

5.5 讨论... 72

第6章 主要结论与展望... 75

6.1 主要结论... 75

6.2 创新点... 75

6.3 展望... 76

参考文献... 77

致 谢... 87

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 89