硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种广泛存在海洋生物中的糖胺聚糖，具有显著的抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性。然而，天然CS多糖存在结构复杂、分子量不均一等问题，阻碍了其构效关系与作用机制研究。为了解决这一问题，本研究以硫酸软骨素A（CSA）为原料，建立了一套“酶法降解与酶法半合成”策略，旨在制备系列结构明确的均一链长CS寡糖，建立CSA寡糖库，并系统评价其抗凝血活性及其构效关系与作用机制。

本研究以CSA多糖为原料，利用透明质酸酶对其进行可控酶解，获得一系列具有非还原端结构完整的CSA寡糖，结合膜过滤、离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术，分离纯化得到了偶数聚合度的CSA寡糖（CSA4、CSA6、CSA8、CSA10）。然后，以上述偶数寡糖为底物和糖核苷酸UDP-GalNAc为供体，利用重组软骨素合酶PmCS，成功合成出相应的奇数聚合度CSA寡糖（CSA5、CSA7、CSA9），从而构建了具有完整结构CSA四糖至十糖寡糖库。通过高效液相色谱（HPLC）、质谱（ESI-MS）和核磁共振（NMR）等技术对CSA寡糖进行表纯度分析、分子量测定与结构特征。

通过对合成的CSA寡糖进行体外抗凝血活性评测，包括活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）。实验结果表明，CSA寡糖的抗凝血活性呈现明显的链长相关性。在内源性通路（APTT）中，抗凝血活性随聚合度增加而增强；而在外源性通路（PT）中，低聚合度寡糖反而表现出更强的作用；对于共同通路末端（TT），高聚合度（≥CSA8）寡糖有显著延长效果。分子对接研究结果显示，CSA8能够与抗凝血酶III（AT III）相互作用，且与肝素的结合位点相似，提示其可能通过类似肝素的变构激活机制增强对凝血酶的抑制。

本研究首次将酶法降解与酶法合成相结合，成功制备合成了一系列链长均一的CSA寡糖（四糖至十糖），建立了高质量CSA寡糖库，为深入研究CSA的构效关系提供了高质量的寡糖分子。此外，本论文还阐明了糖链长度对CSA抗凝活性的调控规律，揭示了其通过作用于AT III而实现抗凝血活性的作用机制。研究成果还将为开发海洋新型安全、高效的海洋糖类抗凝药物奠定了重要的理论依据和物质基础。

1.2 海洋硫酸软骨素：结构特征与生物活性... 3

1.2.1 结构特征... 3

1.2.2 硫酸软骨素的生物活性... 4

1.2.2.1 抗肿瘤活性... 4

1.2.2.2 抗炎活性... 5

1.2.2.3 抗凝血活性... 5

1.2.2.4 神经保护活性... 6

1.2.2.5 其它生物活性... 7

1.3 硫酸软骨素寡糖的制备方法... 8

1.3.1 化学法... 8

1.3.2 酶法... 10

1.3.3 化学-酶法... 11

1.3.4 生物合成法... 12

1.3.5 其它方法... 13

1.4 本课题的选题意义、研究内容与技术路线... 14

1.4.1 选题依据与研究意义... 14

1.4.2 研究内容... 14

1.4.3 技术路线... 15

第2章 硫酸软骨素A（CSA）偶数寡糖的酶解制备... 16

2.1 引言... 16

2.1.1 实验试剂与耗材... 16

2.1.2 实验仪器... 17

2.2 实验方法... 18

2.2.1 CSA偶数寡糖酶解条件优化... 18

2.2.2 CSA偶数寡糖平均Mw分析... 18

2.2.3 CSA偶数寡糖多级分离纯化... 18

2.2.4 CSA偶数寡糖的纯度分析及结构表征... 19

2.3 结果与讨论... 19

2.3.1 CSA偶数寡糖最佳酶解条件的确定... 19

2.3.2 CSA偶数寡糖的分离纯化... 22

2.3.3 CSA偶数寡糖的纯度分析及结构表征... 23

2.4 本章小结... 31

第3章 CSA奇数寡糖的酶法半合成... 33

3.1 引言... 33

3.1.1 实验试剂... 33

3.1.2 实验仪器... 34

3.1.3 工具酶及来源... 35

3.1.4 缓冲液配置... 35

3.2 实验方法... 36

3.2.1 工具酶的诱导表达... 36

3.2.2 工具酶的纯化... 36

3.2.3 糖核苷酸供体UDP-GalNAc的合成... 37

3.2.4 糖核苷酸供体UDP-GalNAc的纯化与表征... 37

3.2.5 CSA奇数寡糖的制备... 38

3.3 结果与讨论... 38

3.3.1 工具酶的表达与纯化... 38

3.3.2 糖核苷酸供体UDP-GalNAc的一锅法酶法合成... 41

3.3.3 糖核苷酸供体UDP-GalNAc的纯化与结构表征... 42

3.3.4 CSA奇数寡糖的制备与表征... 45

3.4 本章小结... 50

第4章 CSA寡糖抗凝活性研究... 52

4.1 引言... 52

4.1.1 实验试剂... 52

4.1.2 实验仪器... 53

4.2 实验方法... 53

4.2.1 抗凝血活性分析... 53

4.2.2 分子对接与模拟... 54

4.3 结果与讨论... 54

4.3.1 抗凝血活性分析... 54

4.3.2 CSA寡糖的抗凝血作用机制... 57

4.4 本章小结... 58

第5章 结论与展望... 60

5.1 结论与创新点... 60

5.2 本论文的不足之处及展望... 60

参考文献... 61

附录 不同聚合度CSA寡糖NMR图... 71

致 谢... 81

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果    83