亚历山大藻（Alexandrium）是甲藻门中备受关注的一个属，包括多个产毒的有害藻华（harmful algal blooms, HABs）物种，可以合成麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins, PSTs），对海水养殖业、生态系统稳定性和公共健康构成严峻威胁。为了减少亚历山大藻的危害，一系列针对亚历山大藻的检测技术得到开发。然而，由于产毒亚历山大藻与不产毒亚历山大藻的形态高度相似，传统的形态学检测技术往往难以进行准确区分。基于分子标记的宏条形码技术突破了传统形态学方法的局限，为亚历山大藻的检测提供了有效的手段。但不同分子标记的分辨率尚未进行系统比较，加之分子标记参考序列数据库的完整性不足，限制了宏条形码分析技术的应用，阻碍了对我国典型海域亚历山大藻多样性和时空动态分布的解析。针对以上问题，本研究综合运用了单细胞分离和扩增、高通量测序、宏条形码分析、系统发育分析等手段，完善了亚历山大藻18S rDNA V4数据库，首次构建了亚历山大藻28S rDNA D1–2的参考序列数据集，明确了28S rDNA D1–2具有更高的物种分辨率；应用宏条形码技术解析了有害藻华高发海域山东近海和秦皇岛海域亚历山大藻等有害藻华物种的时空动态变化；解析了亚历山大藻产毒基因sxtA4的分子多样性。本研究取得了以下认识：

（1）亚历山大藻通用分子标记的多样性评估和参考序列数据库的构建

本研究通过挖掘和整理NCBI NT数据库发现，亚历山大藻单个物种的18S rDNA V4和28S rDNA D1–2分子标记在数据库中存在大量序列，可能代表较高水平的基因组内变异（intragenomic variations, IGVs），即每一个藻细胞中同时存在丰度较高的优势序列（dominant amplified variant, dASV）以及丰度较低的非优势序列（ndASV）。不仅如此，一个物种的不同株系可能存在不同的优势序列。针对亚历山大藻18S rDNA V4的单细胞扩增和高通量测序证明了IGVs的存在。值得注意的是，部分非优势序列与其他物种的优势序列高度相似，为保证鉴定的准确性，建议在参考数据库中仅收录每个亚历山大藻物种的优势序列。本研究在NCBI NT数据库发现了PR²数据库（版本5.0.0）未收录的两个亚历山大藻物种（Alexandrium limii、Alexandrium ogatae）的18S rDNA V4序列，并通过系统发育分析发现PR²数据库中存在两条不属于亚历山大藻的错误序列。这些结果已提交至PR²数据库。此外，本研究首次构建了亚历山大藻28S rDNA D1–2的数据集，包括38条序列，代表27个已知亚历山大藻物种和11个可能存在但尚未描述的亚历山大藻物种。基于上述分子标记序列开展的系统发育分析和物种间序列相似度比较分析证实了分子标记28S rDNA D1–2对亚历山大藻具有比18S rDNA V4更高的物种分辨率。

（2）山东近海亚历山大藻多样性和时空动态分布的宏条形码分析

山东近海是我国有害藻华的典型海域，近年来有害藻华事件呈高发态势，造成的生态危害与经济损失日益严峻，亟待开展系统性的监测与防控研究。本研究应用新建的亚历山大藻18S rDNA V4和28S rDNA D1–2数据库，利用宏条形码方法解析了山东近海四个季节亚历山大藻的多样性和时空动态分布。由于多个引物被用于扩增28S rDNA D1–2序列的不同区域，本研究首先比较了不同引物扩增子的物种分辨率。比较分析发现引物DinoF/DinoR（Liu et al., 2023）扩增得到的片段对亚历山大藻物种比引物D1R/D2C（Scholin et al., 1994）和D1R/305R（Smith et al., 2017）有更高的分辨率。因此，本研究利用DinoF/DinoR引物开展了基于28S rDNA D1–2的宏条形码分析，该分析在山东近海鉴定出11个亚历山大藻物种，多于基于18S rDNA V4的宏条形码分析鉴定出的7个亚历山大藻物种，进一步证实了28S rDNA D1–2的高分辨率。亚历山大藻物种在山东近海表现出强烈的季节动态，除链状亚历山大藻在冬季和春季相对丰度更高外，多数物种在夏季和秋季相对丰度较高。分析表明，温度是关联山东近海亚历山大藻物种季节动态变化的最主要环境因子。本研究表明基于引物DinoF/DinoR扩增的28S rDNA D1–2区域的宏条形码分析方法可广泛应用于亚历山大藻物种的检测及其时空动态研究。这项工作填补了山东近海亚历山大藻的多样性及时空动态变化数据的空白。

（3）秦皇岛海域典型有害藻华物种的时间变化

秦皇岛海域是我国有害藻华的另一典型海域，因地理环境封闭、富营养化加剧，有害藻华事件频发且致灾物种不断增多。链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）和裸甲藻（Gymnodinium spp.）是秦皇岛海域的典型有害藻华物种。由于上述研究表明不同分子标记的选择影响亚历山大藻多样性分析结果，本研究构建了裸甲藻属的首个多分子标记参考序列数据库（18S rDNA V4、28S rDNA D1–2（Liu et al., 2023）、28S rDNA D1–2（Smith et al., 2017）和28S rDNA D1–6），并评估了这些分子标记的分辨率，发现28S rDNA D1–2（Liu et al., 2023）对裸甲藻具有最高的分辨率。随后，采用基于多分子标记的宏条形码方法，结合形态学观察，解析了秦皇岛海域链状亚历山大藻和裸甲藻属的时间演替规律：链状亚历山大藻为冷水种，春季（4月18日）是其高发时期，需对麻痹性贝类毒素中毒（paralytic shellfish poisoning, PSP）事件进行重点预警与防范；裸甲藻则主要在夏季（6月11日）出现，虽丰度不高，但在全球变暖背景下仍具有潜在的有害藻华风险。温度是与上述有毒有害藻种时间变化相关的重要因素。本研究揭示了关键致灾物种的精细变化规律，为有害藻华的早期检测与风险评估提供了方法学范例和科学依据。

（4）亚历山大藻PST合成基因sxtA4的分子多样性的高通量测序解析

上述核糖体分子标记无法反映亚历山大藻的产毒特征，毒素合成基因的存在与否是判断亚历山大藻是否产毒的关键依据。本研究对亚历山大藻的PST毒素基因sxtA4进行高通量三代测序和DADA2分析，发现亚历山大藻sxtA4具有高度的基因组内变异，并且不同序列的相对丰度相近，即不存在明显的优势序列和非优势序列，这一特征与核糖体标记的IGVs模式不同；该研究还发现sxtA4基因型与藻株的地理分布有关。本研究为开发基于毒素合成基因的产毒亚历山大藻检测方法提供了重要基础。

综上，本研究通过解析重要分子标记的分子多样性、优化18S rDNA V4参考序列数据库和构建28S rDNA D1–2参考序列数据库、解析毒素合成基因的分子多样性，结合宏条形码分析揭示了亚历山大藻在山东近海和秦皇岛海域的时空动态变化规律，系统提升了对亚历山大藻和其他藻类分子标记和重要功能基因多样性的认识，为开发基于分子标记和功能基因的检测技术提供了抓手。相关成果不仅为亚历山大藻的生态学研究提供了可靠的工具和数据支撑，也为其他有害藻华的精准监测与风险预警提供了重要的方法学范例。

 

目  录

 

                                        

第1章 绪论... 1

1.1 亚历山大藻有害藻华... 1

1.1.1 有害藻华概述... 1

1.1.2 亚历山大藻有害藻华概述... 1

1.2 亚历山大藻简介... 3

1.2.1 亚历山大藻分类地位... 3

1.2.2 亚历山大藻生活史... 6

1.2.3 亚历山大藻分布及影响的环境因素... 7

1.2.4 亚历山大藻食性... 8

1.2.5 亚历山大藻形态学... 8

1.3 亚历山大藻分子学研究现状... 9

1.3.1 常规核糖体分子标记... 9

1.3.2 基因组内变异... 11

1.3.3 亚历山大藻毒素和产毒基因... 11

1.4 研究目的、内容和意义... 14

第2章 亚历山大藻18S rDNA V4和28S rDNA D1-2序列的评估和数据库的构建... 17

2.1 前言... 17

2.2 材料与方法... 19

2.2.1 亚历山大藻18S rDNA V4和28S rDNA D1-2参考序列的挖掘与特征分析... 19

2.2.2 单细胞分离、DNA提取、PCR扩增和测序... 20

2.2.3 单细胞高通量测序数据分析... 21

2.2.4 图表制作... 21

2.3 结果... 22

2.3.1 PR²数据库中亚历山大藻18S rDNA V4序列的补充与质量评估... 22

2.3.2 从NCBI NT数据库和单细胞测序获得的亚历山大藻18S rDNA V4序列特征分析揭示了高水平IGVs的存在... 23

2.3.3 从NCBI NT数据库获得的亚历山大藻28S rDNA D1-2序列特征分析揭示了高水平IGVs的存在... 27

2.3.4 亚历山大藻18S rDNA V4和28S rDNA D1-2参考数据库的构建... 31

2.3.5 亚历山大藻18S rDNA V4与28S rDNA D1-2分辨率的比较... 32

2.4 讨论... 34

2.5 结论... 38

第3章 基于18S rDNA V4和28S rDNA D1-2的山东近海亚历山大藻多样性和分布的宏条形码分析... 39

3.1 前言... 39

3.2 材料与方法... 40

3.2.1 山东近海采样... 40

3.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序... 41

3.2.3 数据分析... 41

3.3 结果... 42

3.3.1 亚历山大藻28S rDNA D1-2区高分辨率分子标记的评估与筛选... 42

3.3.2 山东近海亚历山大藻物种多样性... 46

3.3.3 山东近海亚历山大藻的时空分布... 49

3.3.4 温度是亚历山大藻分布的关键环境驱动因子... 53

3.4 讨论... 55

3.5 结论... 57

第4章 多分子标记分析秦皇岛海域链状亚历山大藻的时间演替... 59

4.1 前言... 59

4.1.1 秦皇岛海域概述... 59

4.1.2 链状亚历山大藻概述... 60

4.1.3 裸甲藻概述... 60

4.1.4 核糖体分子标记... 61

4.2 材料与方法... 62

4.2.1 采样... 62

4.2.2 显微镜观察拍照... 63

4.2.3 DNA提取、PCR扩增和测序... 63

4.2.4 数据处理... 64

4.2.5 软件使用... 64

4.3 结果... 65

4.3.1 形态学分析秦皇岛海域链状亚历山大藻的时间演替... 65

4.3.2 多分子标记分析秦皇岛海域链状亚历山大藻的时间演替... 67

4.3.3 裸甲藻的多分子标记数据库... 71

4.3.4 多分子标记分析秦皇岛裸甲藻的时间演替及驱动的环境因素... 74

4.4 讨论... 77

4.5 结论... 80

第5章 产毒亚历山大藻sxtA4基因的分子多样性解析... 81

5.1 前言... 81

5.2 材料与方法... 82

5.2.1 株系分离与培养... 82

5.2.2 藻泥收集、DNA提取、PCR扩增和测序... 83

5.2.3 数据处理与图表制作... 83

5.3 结果... 84

5.3.1 克隆测序结果揭示的亚历山大藻sxtA4分子多样性... 84

5.3.2 三代测序结果揭示的亚历山大藻sxtA4分子多样性... 85

5.4 讨论... 91

5.5 结论... 93

第6章 总结与展望... 95

6.1 总结... 95

6.2 主要创新点... 96

6.3 展望... 96

参考文献... 99

附录一  PR²数据库（版本5.0.0）覆盖18S rDNA V4区域的亚历山大藻物种... 111

附录二  NCBI NT数据库中亚历山大藻18S rDNA V4序列... 112

附录三  NCBI NT数据库中亚历山大藻28S rDNA D1-2序列... 114

附录四  亚历山大藻18S rDNA V4非优势序列的测序方法... 120

附录五  裸甲藻属发生有害藻华的物种... 121

附录六  裸甲藻18S rDNA V4数据集... 122

附录七  裸甲藻28S rDNA D1-2（Liu et al., 2023）数据集... 123

附录八  裸甲藻28S rDNA D1-2（Smith et al., 2017）数据集... 124

附录九  裸甲藻28S rDNA D1-6数据集... 125

致  谢... 126

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 127