甲藻(dinoflagellates)是广泛存在于海洋和淡水环境中的一类原生生物，具有重要的生态学作用。部分甲藻能够产生藻毒素或形成有害藻华，威胁人类健康和生态安全。甲藻具有独特的细胞核结构，其染色体在细胞周期过程中始终处于高度凝聚状态，且缺乏组蛋白和核小体结构。在以往研究中，对甲藻染色体的精细观察主要通过电子显微镜进行，但操作过程复杂，且设备昂贵。近年来，膨胀显微技术(expansion microscopy, ExM)得到快速发展，因其能够突破光学衍射极限，已在动物细胞和组织观察中得到广泛应用，但目前尚未应用于甲藻。对此，本研究计划建立适用于甲藻细胞的ExM实验流程，并将其应用于不同种类甲藻细胞的膨胀放大；在此基础上提出一种基于ExM结合荧光染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的甲藻染色体观察方法，进而探究亚历山大藻细胞生殖过程中染色体形态变化和行为特征。通过研究得到以下结果：

(1)构建了甲藻细胞膨胀显微技术实验流程。以红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)为实验材料，通过实验对ExM实验流程中的关键参数进行了优化，将凝胶配方中丙烯酸钠和丙烯酰胺浓度分别选定为188 g/L和100 g/L，锚定时间确定为2 h。应用该实验流程，可以将红色赤潮藻细胞膨胀约4.8倍，膨胀后的藻细胞形态完整，细胞核轮廓清晰可见。理论估算结果表明，该方法可将光学显微镜(分辨率为200-250nm)下样品成像分辨率提升至40-70 nm左右。

(2)对比分析了不同种类甲藻细胞膨胀效果。基于优化后的甲藻ExM实验体系，对多种甲藻细胞进行膨胀，并对比了无甲板和具甲板甲藻细胞的膨胀效果。结果表明，剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)和链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)等无甲板甲藻的细胞膨胀倍数可达4-5倍；而具甲板的亚历山大藻属(Alexandrium)和原甲藻属(Prorocentrum)甲藻的细胞膨胀倍数较低，其中具多片甲板的亚历山大藻细胞膨胀倍数约为3倍，而具致密双壳结构的原甲藻属甲藻细胞膨胀倍数仅为2-3倍。推测甲板结构限制了凝胶渗透和细胞膨胀，从而降低了细胞膨胀倍数。

(3)发展了一种甲藻细胞染色体观察方法并应用于甲藻细胞分裂过程研究。基于ExM实验体系，结合DAPI染色方法，成功实现了对多种甲藻染色体的高分辨率成像，清晰展示了不同甲藻物种细胞核的形态特征。应用该方法对同步化培养的亚历山大藻染色体进行观察研究，系统呈现了链状亚历山大藻有丝分裂过程中染色体的形态变化和分离行为，并在太平洋亚历山大藻中观察到类似于与有性生殖相关的U形核融合现象，以及独特的Y形和V形等特殊细胞核形态。

综上所述，本研究建立并优化了一套适用于甲藻细胞的ExM实验体系，实现了对甲藻细胞的物理放大，结合DAPI染色方法，可以在光学显微镜下对甲藻细胞的染色体形态进行精细观察，并应用该技术对亚历山大藻细胞生殖过程中染色体形态变化和行为特征进行了研究。研究结果可为甲藻细胞核型分析以及核功能基因定位研究提供备选的创新性技术手段，也为深入探究甲藻生活史过程和赤潮形成机理开辟了新的研究路径。

第 1 章 绪论.....................................................................................................1

1.1 简介.....................................................................................................................1

1.2 甲藻生物学特征.................................................................................................2

1.2.1 分类地位及生态学意义..............................................................................2

1.2.2 细胞形态结构..............................................................................................3

1.2.3 细胞生殖方式..............................................................................................5

1.3 膨胀显微技术(ExM)概述...............................................................................6

1.3.1 膨胀显微技术原理......................................................................................6

1.3.2 膨胀显微技术发展现状..............................................................................8

1.4 研究目的、内容与意义.....................................................................................9

第 2 章 甲藻细胞膨胀实验流程及条件优化 ....................................................11

2.1 前言...................................................................................................................11

2.2 实验仪器...........................................................................................................11

2.3 实验试剂...........................................................................................................12

2.4 实验材料...........................................................................................................12

2.5 实验方法...........................................................................................................12

2.5.1 准备工作....................................................................................................12

2.5.2 细胞收集....................................................................................................13

2.5.3 细胞固定....................................................................................................13

2.5.4 细胞锚定....................................................................................................14

2.5.5 细胞凝胶化................................................................................................14

2.5.6 变性............................................................................................................14

2.5.7 膨胀............................................................................................................15

2.5.8 光学成像....................................................................................................15

2.5.9 细胞膨胀倍数的测定................................................................................15

2.5.10 统计学分析..............................................................................................15

2.6 实验结果...........................................................................................................16

2.6.1 不同凝胶配方对甲藻细胞膨胀效果的影响............................................16

2.6.2 不同锚定时间对甲藻细胞膨胀效果的影响............................................18

2.7 讨论...................................................................................................................20

2.7.1 膨胀显微技术应用于甲藻的优势与局限................................................20

2.7.2 膨胀显微技术在甲藻生物学研究中的应用潜力....................................21

2.8 小结...................................................................................................................22

第 3 章 无甲板与具甲板甲藻细胞膨胀效果的比较研究...................................25

3.1 前言...................................................................................................................25

3.2 实验仪器...........................................................................................................25

3.3 实验试剂...........................................................................................................25

3.4 实验材料...........................................................................................................25

3.5 实验方法...........................................................................................................26

3.5.1 准备工作....................................................................................................26

3.5.2 细胞收集....................................................................................................26

3.5.3 细胞固定....................................................................................................26

3.5.4 细胞锚定....................................................................................................26

3.5.5 细胞凝胶化................................................................................................26

3.5.6 变性............................................................................................................27

3.5.7 膨胀............................................................................................................27

3.5.8 光学成像....................................................................................................27

3.5.9 细胞膨胀倍数的测定................................................................................27

3.5.10 统计学分析..............................................................................................27

3.6 实验结果...........................................................................................................27

3.6.1 两种无甲板甲藻细胞膨胀效果................................................................27

3.6.2 三种亚历山大藻细胞膨胀效果................................................................30

3.6.3 三种原甲藻细胞膨胀效果........................................................................32

3.7 讨论...................................................................................................................34

3.8 小结...................................................................................................................35

第 4 章 甲藻染色体成像方法及应用 .................................................................37

4.1 前言...................................................................................................................37

4.2 实验仪器...........................................................................................................38

4.3 实验试剂...........................................................................................................38

4.4 实验材料...........................................................................................................39

4.5 实验方法...........................................................................................................39

4.5.1 细胞同步培养............................................................................................39

4.5.2 细胞膨胀处理............................................................................................40

4.5.3 DAPI 染色 ..................................................................................................40

4.5.4 成像............................................................................................................40

4.6 实验结果...........................................................................................................40

4.6.1 三种无甲板甲藻染色体成像....................................................................40

4.6.2 三种亚历山大藻染色体成像....................................................................41

4.6.3 三种原甲藻染色体成像............................................................................42

4.6.4 亚历山大藻有丝分裂过程中染色体的形态与行为................................43

4.7 讨论...................................................................................................................47

4.7.1 甲藻染色体数目与细胞核大小的关系....................................................47

4.7.2 膨胀显微技术在甲藻生殖与生活史研究中的应用潜力........................48

4.8 小结...................................................................................................................50

第 5 章 总结与展望 ............................................................................................51

5.1 总结与结论.......................................................................................................51

5.2 不足与展望.......................................................................................................51

参考文献..................................................................................................................53

致谢...........................................................................................................................63

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果........................65