核酸适配体亲和整体色谱柱的制备及对靶蛋白的分离分析
文献类型：学位论文
| 作者 | 韩彬 |
| 学位类别 | 博士后 |
| 答辩日期 | 2012-03 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | 适配体 亲和色谱 整体柱 溶菌酶 高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱 aptamer affinity chromatography monolith column lysozyme quadrupole-time-of-flight mass spectrometry ( HPLC-MALDI-TOF MS) |
| 其他题名 | The Preparation of Nucleic Acid Aptamer Affinity Monolithic Chromatography Column for Separation Analysis of Target Protein |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 核酸适配体具有优于抗体的特点，其作为识别探针在生物分析检测中的应用得到了广泛关注。特别是在亲和色谱领域，适配体作为亲和配体固载在分离介质表面，能够高亲和力、高特异性地选择识别靶分子，能够提供较高的产品产量和纯度，可以用于目标物的分离纯化、低丰度靶标的富集捕获以及疾病相关标志物的高灵敏度检测。 本论文选用功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和交联剂乙烯基二甲基丙烯酸酯（EDMA），在液相色谱柱管中合成了poly(GMA-co-EDMA)有机聚合物整体柱，并通过乙二胺/戊二醛连接臂成功地将5’氨基修饰的可形成茎环高级结构的溶菌酶DNA 适配体共价键合在聚合物整体柱的表面，制备了适配体亲和液相整体柱。亲和柱的适配体键合量达到290 pmol/μL，优于文献报道的毛细管颗粒填充柱以及毛细管整体柱中固载的适配体容量，且柱体渗透性较好，背压较低，有利于生物大分子的传质分离，同时引入16 个原子的连接臂可减少空间位阻效应，保证适配体分子形成较合适的空间构象。 将适配体HPLC 亲和整体柱接入高效亲和色谱体系对靶分子溶菌酶进行特异性分离的实验结果表明，溶菌酶可以与具有相似等电点的碱性蛋白特异性地提取分离，且精密度和重现性良好。而且，成功地实现了从较复杂的蛋清实际样品中对靶分子溶菌酶的捕获和分离。此方法操作简便、快速高效、成本低廉。 此外，建立了一种适配体亲和高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱在线检测靶蛋白的方法。将兼容质谱的有机流动相乙腈作为适配体亲和整体柱上捕获靶蛋白的洗脱流动相，然后将捕获并洗脱的溶菌酶送入质谱进行检测，最终通过质谱对洗脱物进行高灵敏度、高质量分辨率和准确度的分析鉴定。实验结果表明，洗脱组分中只存在靶分子溶菌酶，且没有其它杂蛋白的干扰，有效地证实了亲和柱捕获靶蛋白的专一性，验证了所建立方法的可行性，并成功地应用于蛋清中溶菌酶的在线分离鉴定。 |
| 公开日期 | 2014-05-14 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/7234]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 韩彬. 核酸适配体亲和整体色谱柱的制备及对靶蛋白的分离分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2012. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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