超高效液相色谱-串联质谱检测DNA修饰的方法发展及其应用研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 尹瑞川 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | 丙烯醛-DNA 加合物 碳酸氢铵 非dG 加合物 5’-甲基胞嘧啶氧化产物 Tet DNA 去甲基化 维生素C Acr-DNA adducts ammonium bicarbonate nondG adducts 5’- methylcytosine oxidation products ten eleven translocation DNA demethylation vitamin C |
| 其他题名 | Development of Methods for Detection of Modified DNA Bases Using UHPLC-MS/MS and their Application |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 丙烯醛是一种活泼的α, β 不饱和醛，也是一种典型的环境污染物。丙烯醛能直接与DNA 发生反应，生成多种丙烯醛-DNA 加合物，而这些加合物与吸烟相关的肺癌、阿兹海默病和一些心血病等密切相关。因而，准确测定人体内痕量的丙烯醛-DNA 加合物是理解丙烯醛暴露和其毒理病理效应的关键。 高效液相色谱串联质谱方法（HPLC-MS/MS）具有灵敏度高、定量准确、操作安全等优点，已应用于丙烯醛-dG 加合物（AcrdG）的检测中。在人体胎盘、肺组织、口腔组织和白细胞中都检测到AcrdG。尽管人体内，α-AcrdG 含量低于γ-AcrdG，但其致突变性高于γ-AcrdG，因而α-AcrdG 应引起更多的关注。此外，目前还不清楚人细胞内是否含有丙烯醛-dA 加合物（AcrdA）和dC 加合物（AcrdC）。这些非dG 加合物的研究有助于我们更好解释丙烯醛的毒理效应。 本文首先阐述丙烯醛-DNA 加合物的制备、纯化及鉴定过程，包括包括α-AcrdG、γ-AcrdG、AcrdA、AcrdC 和相应的同位素加合物。利用这些标准品，发展了一种NH4HCO3增强的、稳定同位素稀释的超高效液相色谱串联质谱方法（UHPLC-MS/MS），同时检测人白细胞内AcrdG、AcrdA 和AcrdC。该方法的创新之处：以NH4HCO3 作为流动相添加剂。与HCOOH、HCOONH4 和CH3COONH4 相比，NH4HCO3 不仅提高了丙烯醛-dG 加合物异构体的分离度，还能显著抑制ESI 过程中金属复合物的生成，进而增加了丙烯醛-dG 加合 物的质子化效率，其质谱检测灵敏度提高了4.2 倍（与HCOOH 相比）。该方法中，丙烯醛-DNA 加合物的检出限（LOD）在40-80 amol 之间，这与纳流液相色谱-纳流电喷雾-串联质谱方法的灵敏度相当。尽管γ-AcrdG 是所有样品中的主要加合物，但人白细胞样品也含有少量的α-AcrdG。此外，在所有的人白细胞样品中均检测到了Acr-dA，其含量非常接近于γ-AcrdG。在大部分样品中均可检测到AcrdC。这些数据表明在人体内存在这两种非dG加合物。 我们还发现NH4HCO3 的增强效应同样适用于5’-甲基胞嘧啶氧化产物的高灵敏分析中。哺乳动物体内Tet（ten eleven translocation）能氧化5’-甲基胞嘧啶（5mC），生成5’-羟甲基、5’-醛甲基和5’-羧甲基胞嘧啶（5hmC、5fC 和5caC）。这三种氧化产物与DNA 去甲基化密切相关，在细胞克隆、细胞核重新编程、胚胎发育等过程中起着重要的作用。然而，人细胞中5hmC 含量比小鼠胚胎干细胞中5hmC 含量低13 倍，而比小鼠脑组织中5hmC低接近100 倍，而5fC 和5caC 含量又比5hmC 低100 倍左右。因而，如何灵敏而准确定 量人细胞内5’-甲基胞嘧啶氧化产物（5hmC, 5fC 和5caC）仍是一个难题。 我们发展的NH4HCO3 增强的、高灵敏的UHPLC-MS/MS 方法，可应用于测定人细胞内5’-甲基胞嘧啶氧化产物。与甲酸相比，NH4HCO3 促使5hmC 和5fC 检测灵敏度提高了3-4 倍。利用该方法，我们实现了四种培养的人细胞内痕量5hmC 的准确定量。在A549、MRC5、293T 和MCF-7 细胞内，5hmC 含量在20.5-281.9 个/ 10 6C 之间。 利用发展的高灵敏分析方法，我们进一步研究了一种重要营养物质（维生素C）与Tet的作用。体外氧化实验证明了维生素C 能显著增强Tet 酶活性，与对照相比，5hmC 和5fC产率提高了3-6 倍，其生成速率升高了5.1-7.1 倍，而其它强还原剂并不能增强Tet 的催化活性，这表明维生素C 是Tet 的独特辅助因子。荧光猝灭数据表明维生素C 能与Tet 非共价结合，其结合常数为8.7×103 M-1。维生素C 处理后，野生型小鼠胚胎干细胞内5mC 氧化产物生成量提高了2.7-26 倍，同时5mC 水平下降了13%-40%。维生素C 不能引起Tet1和Tet2 双敲除型小鼠胚胎干细胞内的5mC 水平显著下降，而且5hmC 含量远低于野生型处理组。这些数据表明维生素C 通过Tet，促进小鼠胚胎干细胞内5mC 氧化产物的生成和DNA 去甲基化过程。在Tet 转染的293T 细胞内再次验证了这个结论。 GO（Gene ontology）和富集分析表明维生素C 引起小鼠胚胎肝细胞内545 个基因富集5hmC。这些基因与细胞分化、各种组织发育（包括脑、肌肉、心脏、血液、上皮等）、磷酸化、蛋白质合成和复合体组装、行为、转运、细胞周期和信号传导等功能密切相关。这些数据表明维生素C 通过5hmC 的生成，能够调控众多的生物功能。选取同卵sfx / sfx 小鼠作为模型动物，这种小鼠不能合成维生素C，只能通过食物摄取。维生素C 摄入显著提高了小鼠肝脏、肺、脑组织中5hmC 含量，明显降低了小鼠肝脏和脑组织中5mC 含量。结果表明，维生素C 能促进哺乳动物体内5mC 氧化和DNA 去甲基化过程。 本文建立了维生素C、Tet 和DNA 去甲基化之间的直接联系，具有重要的生物学意义。维生素C 是人体必需的一种营养物，并普遍存在于各种组织，因而可以推测通过Tet，维生素C 参与了细胞内DNA 甲基化的动态调节过程，进而参与特定基因的转录调控中。这也更全面地解释一些维生素C 的生物学功能，例如很可能与维生素C 促进诱导的全能干细胞（iPSC）转化率有关。 |
| 公开日期 | 2014-07-14 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/7580]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 尹瑞川. 超高效液相色谱-串联质谱检测DNA修饰的方法发展及其应用研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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