牙鲆抗寒相关基因的差异表达谱及SNP筛选研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 胡金伟 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2014-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 尤锋 |
| 关键词 | 牙鲆（Paralichthys olivaceus） 低温胁迫 RNA-seq CIRP 克隆 RT-PCR SNP HMGB1和APO-AIV |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 中文摘要 | 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水养殖鱼类，属于温水性鱼类，其最适生长温度为14~23°C。人工养殖条件下，在冬季需要提温才能维持其正常的生长甚至成活，因此，如何提高其低温耐受性受到普遍关注。本研究利用转录组学，初步明确牙鲆耐低温相关基因，并筛选3个主要基因进行克隆和表达分析，还进行了耐低温相关SNP的筛选，以期为阐明牙鲆的耐寒机理以及低温牙鲆选育提供分子基础。具体结果如下： 首先，通过预备实验确定了低温胁迫实验的条件，分别获得了低温敏感组和低温耐受组鱼样品，同时设置对照组。对各组鱼样品的组织切片观察发现，低温下牙鲆鳃小片的表皮细胞与血管脱离，鳃丝末端肿大，肌纤维间隙变大。酶活力测定结果显示，丙酮酸激酶活力在低温耐受组中显著高于低温敏感组（P<0.05）；低温耐受组中ATP含量显著高于对照组和低温敏感组（P<0.05），低温敏感组的ATP含量最低，均显著低于对照组和低温耐受组（P<0.05）。 用Illumina Miseq测序平台对牙鲆低温耐受组、低温敏感组及对照组进行转录组测序，共获得29021个unigenes。按照fold change>2和P-value<0.05筛选差异表达基因。与对照组相比，在低温耐受组中发现了410个上调表达的基因和255个下调表达的基因，在低温敏感组中发现了593个上调表达的基因和289个下调表达的基因。GO和KEGG分析发现低温条件下表达发生变化的基因主要集中在信号转导、脂类代谢、蛋白消化、信号分子互作等过程。 通过同源克隆以及5’/3’RACE的方法扩增得到了抗寒相关的CIRP、HMGB1和APO-AIV基因。CIRP的cDNA全长序列共932bp（GenBank 登录号: KC735176），HMGB1的cDNA全长序列共1222bp（GenBank 登录号:KC422724），APO-AIV的cDNA全长序列共1063bp（GenBank 登录号：KC735177）。组织RT-PCR表达谱分析显示，CIRP、HMGB1在脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、肠等组织均有表达，但HMGB-1基因在鳃中表达较弱，而APO-AIV基因有明显的组织特异性：主要在肝脏和肠中表达。低温胁迫实验过程中，3个基因在脑、肌肉、肝脏组织中Real time RT-PCR表达谱结果表明，随着胁迫时间的延长CIRP、HMGB1表达量在肌肉中都出现先上升后下降的趋势：在0~12h逐渐上升并达到最大值，然后下降恢复至最初水平。但在肝脏和脑组织中的变化趋势却不同，HMGB1基因脑中表达量在0~2h上升至最高，然后下降至最初水平，而在肝脏中变化不大。CIRP基因则在肝脏中表达量0~2h处于上升趋势，然后下降至初始水平，在脑中变化不大。APO-AIV在脑和肌肉中先上升，分别在低温处理6h和12h达到最大值，然后下降；肝脏中则先下降后上升。由此，这3个基因在低温条件下可能都参与了机体对外界的抵抗，特别是在抵抗外界低温的主要组织—肌肉中发挥作用，共同参与了机体的免疫反应，对低温胁迫环境下的鱼体进行保护，因此可以作为鱼类耐低温标记筛选的候选基因。 本研究还采用PCR直接测序方法筛选了抗寒候选基因CIRP的4个SNP位点和HMGB1基因的2个SNP位点，在牙鲆低温耐受组以及低温敏感组之间存在显著差异（P<0.05），可初步作为耐低温相关的候选分子标记应用于牙鲆耐低温品系的选育。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2014-08-10 |
| 源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18012]  |
| 专题 | 海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 胡金伟. 牙鲆抗寒相关基因的差异表达谱及SNP筛选研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2014. |
入库方式： OAI收割
来源：海洋研究所
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