基于DNA折纸的DNA复制的原子力显微术研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 王奇 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2014 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院（上海应用物理研究所） |
| 导师 | 李宾 |
| 关键词 | 原子力显微镜 DNA折纸 DNA复制 单分子 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 中文摘要 | DNA复制是生命体内必不可少的重要过程，在基础研究、临床诊断和法医上都有重要应用。DNA复制是新DNA的合成，合成与单链模板DNA完全相同的新的DNA分子，形成DNA双链。尽管对DNA复制研究已经非常深入而细致，然而，单分子水平上DNA复制的研究依然存在挑战，对如何获取一条DNA链由单链转变成双链DNA分子的复制延伸信息缺乏相应检测手段。本文利用DNA折纸寻址性的特点以及原子力显微镜纳米级的高分辨能力，通过成像手段，直接观察DNA聚合酶I片段（KF）与DNA的相互作用过程，在单分子水平上开展对DNA复制延伸过程的检测和表征。研究内容主要围绕两个方面展开：（1）两端固定于DNA折纸上的单个DNA分子的复制和检测；（2）DNA复制过程中单个DNA聚合酶片段（KF）动态过程的实时检测以及其他因素对DNA聚合酶I与DNA相互作用的影响。 （1）两端固定于DNA折纸上的单个DNA分子的复制和检测；首先，通过自组装方法构建三角形DNA折纸，再将DNA模板链通过碱基互补配对连接在折纸的特定位点。凝胶电泳分析和AFM成像检测结果表明，当DNA单链模板链浓度大于DNA折纸浓度10倍以上时，连接效率较好，可达到50%以上。而且，KF能够与一条两端点固定在DNA折纸上的单链DNA模板结合，发挥其聚合能力，使单链DNA模板转变成了双链DNA。通过生物素亲和素分子识别体系，进一步验证了KF了对两末端固定在三角形DNA折纸上单链DNA模板链的复制。 （2）DNA复制过程中单个KF动态过程的实时检测以及其他因素对KF与DNA相互作用的影响。采用AFM成像手段，在云母表面上，实时观察了KF与DNA链的结合、移动以及解离的催化过程。同时，溶液体系结果也表明，在不含有dNTPs情况下，KF大多结合在DNA模板的5’端，而在加入dNTPs后，DNA模板5’端的KF随之减少，提示随着反应的进行，KF的移动方向与新生链合成方向5’端至3’端的方向一致。此外，为了验证此方法的普适性，对相对较长的长链的DNA模板链的复制延伸也进行了检测。通过改变部分订书钉链序列在折纸上获得长模板链的方法，并同样在该模板上检测到了DNA复制。除此之外，我们探索了温度，Mg2+等部分因素对DNA聚合酶的影响。 综上所述，借助DNA折纸程序化定位的优势以及AFM高分辨成像的特点，在单分子水平上达到了对DNA复制过程和结果的检测，此方法对探索DNA复制机制将起到一定借鉴作用，并对探索蛋白质与DNA相互作用提供了一种可行的方法。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2015-03-13 |
| 源URL | [http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/14805]  |
| 专题 | 上海应用物理研究所_中科院上海应用物理研究所2011-2017年 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王奇. 基于DNA折纸的DNA复制的原子力显微术研究[D]. 中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）. 2014. |
入库方式： OAI收割
来源：上海应用物理研究所
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