重组人内皮抑素的基因表达与表征
文献类型：学位论文
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| 作者 | 王群 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2004 |
| 授予单位 | 中国科学院长春应用化学研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院长春应用化学研究所 |
| 关键词 | 内皮抑素 克隆 内皮细胞 凋亡 细胞周期 |
| 其他题名 | Cloning, Expression and Characterization of Recombinant Human Endostatin |
| 学位专业 | 生物无机化学 |
| 中文摘要 | 内皮抑素具有抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤新生血管生成活性，在小鼠实验中对多种肿瘤取得了有效的结果，有望成为一种新型抗肿瘤药物。本论文从基因的获取到在大肠杆菌中的高效表达，系统地研究了重组内皮抑素的全过程，并对其体内、体外的生物学活性及多种光谱学性质进行了深入的研究。采用Trizol试剂改进法从人胚肝组织中制备细胞mR NA，通过RT-PCR方法获得人内皮抑素基因。应用基因工程技术构建了亚克隆载体和表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体方式表达出N-末端带有6XHisTag标签的融合蛋白，表达量最多达到菌体总蛋白的42％。建立了包涵体蛋白的复性和纯化方法，得到具有较高纯度的重组内皮抑素蛋白。首次用质谱法证实从大肠杆菌的包涵体中获得的重组蛋白，因宿主菌中水解甲硫氨酸的酶不能对所有包涵体蛋白起作用，而在目的蛋白中会棍有N-末端具有甲硫氨酸的产物。对内皮抑素基因做定点突变，首次将内皮抑素蛋白的N-末端锌离子结合位点的的His2、His4突变成Leu2、Va14，构建了点突变的亚克隆载体，为以后研究其作用机理提供了条件。重组内皮抑素能够抑制鸡胚尿囊膜血管生成和人脐静脉内皮细胞ECV-304的增殖，在小鼠体内实验中对黑色素瘤产生良好的抑瘤效果（P＜0.01）。通过细胞周期分析，首次发现重组内皮抑素在G2期抑制 ECV-304细胞的增殖。电镜观察发现受内皮抑素作用的ECV-304细胞，产生了凋亡小体并出现多种细胞凋亡特征。同时，首次发现内皮抑素能使Balb／c 3T3细胞产生凋亡。计算机结构模拟结果表明重组内皮抑素蛋白与天然蛋白具有相似的空间结构。研究了内皮抑素与锌离子、肝素、稀土离子作用后蛋白质的光谱学性质和二级结构的变化，首次发现偏酸性pH对肝素与内皮抑素的结合作用有特殊影响，为研究内皮抑素特异抑制肿瘤组织新生血管的生成提供了实验依据。从人胚肝组织出发初步完成了人硒蛋白P亚克隆载体的构建。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2011-01-17 |
| 页码 | 189 |
| 源URL | [http://ir.ciac.jl.cn/handle/322003/34427]  |
| 专题 | 长春应用化学研究所_长春应用化学研究所知识产出_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王群. 重组人内皮抑素的基因表达与表征, Cloning, Expression and Characterization of Recombinant Human Endostatin[D]. 中国科学院长春应用化学研究所. 中国科学院长春应用化学研究所. 2004. |
入库方式： OAI收割
来源：长春应用化学研究所
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