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	进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系及应用专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN201310340730.1, 申请日期: 2013-12-25, 公开日期: 2013-12-25 作者: 相建海; 于洋收藏 \| 浏览/下载：38/0 \| 提交时间：2014/08/04 进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系包括多重微卫星引物体系其特征在于：使用多态性高的LvM1‑LvM15共15对微卫星引物构成两个多重微卫星引物体系所述的两个多重微卫星引物体系如下：1）多重微卫星引物体系1的引物序列和荧光标记组合为：LvM1F:6‑FAM（羧基荧光素）‑5’‑GATGACCTGCCTTTCTCTGC‑3’LvM1R:5’‑GGGAGAGATGATGGGAAGAAG‑3’LvM2F:ROX（羧基X罗丹明）‑5’‑ATGGCACAAATAGGATCTTG‑3’LvM2R:5’‑GACTGGAAGAGCACTGATTC‑3’LvM3F:HEX(六氯荧光素)‑5’‑ATACGAAACACCCCATCCC‑3’LvM3R:5’‑GTGGTCTTACCTCGTGGCTC‑3’LvM4F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)‑5’‑AGCACCTAGCACTTGCTGAAC‑3’LvM4R:5’‑AGAGACTCACATCCTCATCCTC‑3’LvM5F:6‑FAM（羧基荧光素）‑5’‑CATTGAAAACGGAATCCTCG‑3’LvM5R:5’‑GATATTCCCATCAACACAGCG‑3’LvM6F:ROX（羧基X罗丹明）‑5’‑CACCAAAACGAACGAAACG‑3’LvM6R:5’‑GGATAAAAACGAATTGTATACCG‑3’LvM7F:HEX(六氯荧光素)‑5’‑GAGAGCAAATAAGAAAGGGC‑3’LvM7R:5’‑AGGATGCAAATGATAACGAG‑3’LvM8F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)‑5’‑GGCACACTGTTTAGTCCTCG‑3’LvM8R:5’‑CGAACAGAATGGCAGAGGAG‑3’LvM9F:6‑FAM（羧基荧光素）‑5’‑CCCGACTTGGCTTTTAGTTG‑3’LvM9R:5’‑GAGATTGCTATCCTCGGCTG‑3’LvM10F:ROX（羧基X罗丹明）‑5’‑GATCCTGCGAGTCACTTTATCTC‑3’LvM10R:5’‑TTTATTGCGTATCCCAGAAGC‑3’2）多重微卫星引物体系2的引物和荧光标记组合如下：LvM11F:6‑FAM（羧基荧光素）‑5’‑CCGCCATCATCATCAACA‑3’LvM11R:5’‑TCATTCGGGTTCGAGACTC‑3’LvM12F:ROX（羧基X罗丹明）‑5’‑GATCATTCGCCCCTCTTTTT‑3’LvM12R:5’‑ATCTACGGTTCGAGAGCAGA‑3’LvM13F:HEX(六氯荧光素)‑5’‑GGACTCACACTTCTGGTTC‑3’LvM13R:5’‑GGCTGCACCTTGTAAGTC‑3’LvM14F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)‑5’‑TATGCTCGTTCCCTTTGCTT‑3’LvM14R:5’‑TTGAAGGAAAAGTGTTGGGG‑3’LvM15F:6‑FAM（羧基荧光素）‑5’‑ACTAGTGGATCTGTCTATTCAT‑3’LvM15R:5’‑ATACCCACCCATGCATGTTA‑3’。
	一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN201210112325.X, 申请日期: 2012-10-10, 公开日期: 2012-10-10 作者: 刘保忠收藏 \| 浏览/下载：30/0 \| 提交时间：2014/08/04 一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法 2)引物设计：在微卫星重复的侧翼序列利用软件Primer?Premier?5.0设计引物 GC含量为40％?60％退火温度为45?65℃ 预期PCR产物长度为100?400bp 3)引物优化：根据不同引物的Tm值进行温度梯度优化 4)微卫星标记家系鉴定体系的确立：微卫星位点的多态性水平可用信息含量值(PIC)衡量包括微卫星位点来源引物设计条件为：引物长度为19?25mer 在Tm值上下各10℃ 根据上述优化获得的Ta值引物设计温度梯度优化扩增得到的PCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳?EB染色系统进行检测选取多个体作为群体进行计算微卫星位点的多态性水平可用信息含量值(PIC)进而衡量多态性信息引物优化和微卫星标记家系鉴定体系选取杂带较少根据PIC值其特征在于：1)微卫星位点的来源：提取文蛤的基因组DNA利用提取的DNA 特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta PIC小于0.25的标记采用限制性内切酶法获得文蛤基因组DNA片段筛选得到重复性好并构建微卫星磁珠富集文库稳定性好检测阳性克隆 PIC值大于0.25的位点经测序得到含有微卫星重复的DNA序列作为文蛤微卫星标记家系鉴定体系用于文蛤的家系区分与个体识别。
	一种对虾性别探针及其获取方法专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN200910229806.7, 申请日期: 2010-05-19, 公开日期: 2010-05-19 作者: 相建海收藏 \| 浏览/下载：39/0 \| 提交时间：2014/08/04 一种对虾性别探针包括特异性引物其特征在于：所述的特异性引物为只能在雄性个体中扩增的引物序列正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’ 反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’。
	一种简便的转基因大豆检测试剂盒及检测方法专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN200810138673.8, 申请日期: 2010-01-27, 公开日期: 2010-01-27 刘梅; 王雷; 陶冉; 王宝杰; 蒋克勇收藏 \| 浏览/下载：46/0 \| 提交时间：2014/08/04 1.一种简便的转基因大豆检测试剂盒其中内引物FIP和BIP分别为FIP：CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC和BIP：CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA 外侧引物F3和B3分别为F3：CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3：CATGGCCTTGCCCGTATT。包括引物缓冲液 dNTPs DNA聚合酶和对照其特征在于：包括LAMP反应缓冲液2.5μl 内引物FIP和BIP各2μl 外侧引物F3和B3各0.3μl 甜菜碱1.0μl MgSO4溶液2.5ul 荧光染料I2.5μl
	栉孔扇贝G-型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN200810015048.4, 申请日期: 2008-09-03, 公开日期: 2008-09-03 宋林生; 李凌; 赵建民收藏 \| 浏览/下载：32/0 \| 提交时间：2014/08/04 1 2)抗病群体和敏感群体的制备 3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选 4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查。1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆：参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总DNA 根据已知的G-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物即从不同海区和养殖场收集栉孔扇贝个体 PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后其中-754ID和-754II个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差别一种栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记克隆得到一段762个碱基的DNA序列用病原菌浸泡感染针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G转换分别选用Taq I和Hap II对PCR产物进行酶切而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体其特征在于它的技术内容包括以下四个方面：1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆连入T载体后进行测序根据死亡时间判断扇贝对病原菌感染抵抗能力聚丙烯酰胺凝胶电泳后 -391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体。因此获得其核苷酸序列。2)抗病群体和敏感群体的制备：采用人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体将扇贝分为抗病群体和敏感群体。3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选：对来自5个个体的10个克隆进行了测序各发现两种基因型将-391AA作为疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记发现了10处多态性位点 -754II 而将-391AG作为抗病相关的G-型溶菌酶基因标记。4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查：取栉孔扇贝个体全血1μl作为模版 -754ID PCR扩增G-型溶菌酶基因启动区序列 -391AA和-391AG 用Hap II对产物进行酶切聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后选择-391AG个体作为抗病个体。
	龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN200410021012.9, 申请日期: 2005-07-20, 公开日期: 2005-07-20 段德麟; 李文红; 胡自民收藏 \| 浏览/下载：61/0 \| 提交时间：2014/08/04 1.龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法提取缓冲液的组成为：100mmolL-1Tris.HCl (2)PCR扩增：龙须菜ITS区扩增的特异引物P1 P2：5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’ 利用该引物对步骤(1)提取的DNA为模板 (3)PCR产物纯化 (4)DNA序列测定：纯化后的DNA进行序列测定 (5)DNA序列数据分析：待分析的rDNAITS区的序列一经测定建立用于鉴别龙须菜种内和种间差异的RAPD和ISSR特异指纹图谱 2)RAPD和ISSR引物的合成 3)根据扩增条带的多态性其特征在于：龙须菜的rDNAITS全序列的获取 pH8.0 P2的序列分别为：P1：5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’ 位于26S上对总DNA进行PCR扩增反应确立rDNAITS区用对位排列软件ClustalW进行对位排列步骤如下：1)总DNA提取从大量随机引物中筛选出能稳定的扩增出特征条带的引物构建龙须菜选育品系及野生型和相关种的RAPD和ISSR特异指纹图谱。步骤如下：(1)总DNA提取：取新鲜健康的藻体材料 50-100mmolL-1EDTA 位于18S上包括ITS1和5.8S区的全序列并辅以人工校对用无菌水处理后 0.2-0.5MNaCl 用系统进化分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异在液氮种研磨成粉末 5％β-巯基乙醇提取总DNA 0.2％PVP-40 1.0-2.5％SDS 提取所用的KAc浓度为4.0-5.0M pH值范围在5.2-7.5
	中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用专利 OAI收割专利类型: 发明, 专利号: CN03112294.9, 申请日期: 2003-12-03, 公开日期: 2003-12-03 作者: 相建海收藏 \| 浏览/下载：28/0 \| 提交时间：2014/08/04 1.中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法所述的转化与筛选是：将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞所述的表达产物鉴定包括重组载体构建筛选工程菌株或细胞并诱导表达纯化和抗菌谱测定是：采用诱导剂诱导表达的工程菌转化与筛选和表达产物鉴定破细胞收集上清液纯化和抗菌谱测定其特征在于分泌型表达的细胞直接收集上清液所述的重组载体构建是：根据已克隆到的对虾素成熟肽的cDNA序列采用层析的方法纯化抗菌肽利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点并测定抗菌谱。亚克隆到表达载体载体包括pET系列 pGEX-4T系列 pPIC系列 pAO815和杆状病毒表达载体